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L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，是人體和動(dòng)物生命活動(dòng)中必需的氨基酸之一，對(duì)人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝起著重要的作用，被稱為第二必需氨基酸，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料等方面。目前利用微生物生產(chǎn)L-色氨酸的方法主要有酶法、微生物轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法，其中微生物發(fā)酵法是大規(guī)模生產(chǎn) L-色氨酸的首選技術(shù)， 現(xiàn)常用菌株有大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌。大腸桿菌具有生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)成本低、遺傳背景清楚、易實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因而重組大腸桿菌得到廣泛地應(yīng)用。發(fā)酵法生產(chǎn) L-色氨酸的過程中需要加堿調(diào)節(jié)pH 來維持菌體的最適生長(zhǎng)。目前能實(shí)現(xiàn)工藝要求的 pH 調(diào)控劑主要有鈉鹽、鈣鹽、鎂鹽以及濃氨水，前三者有試劑消耗量大、價(jià)格昂貴、下游提取工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)，而采用氨水調(diào)節(jié) pH，不需要消耗大量的試劑，生成的副產(chǎn)物少，具有閉合、清潔、廉價(jià)和高效等優(yōu)點(diǎn)。
大腸桿菌高密度發(fā)酵條件下， 細(xì)胞產(chǎn)生大量的乙酸和 CO2，可使 pH 值顯著降低， 需要通過自動(dòng)流加氨水控制 pH 在 7，銨鹽可以作為發(fā)酵過程中的營(yíng)養(yǎng)物和緩沖劑，但高濃度的 NH4 + 會(huì)嚴(yán)重抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。研究了 NH4 + 對(duì)重組大腸桿菌 E． coli TRTH發(fā)酵生產(chǎn) L-色氨酸的影響，分析了 NH4 + 對(duì)菌體抑制作用的機(jī)理，確定了 L-色氨酸發(fā)酵過程中的最適 NH4 + 濃度，顯著提高了菌體生物量與 L-色氨酸產(chǎn)量。
在 30 L 自控發(fā)酵罐上進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，每隔 2 h測(cè)定菌體生物量、L-色氨酸產(chǎn)量、NH4+ 濃度及比生長(zhǎng)速率等參數(shù)。
由圖 1 可知，NH4 + 大約從 6 h 時(shí)開始積累， 且隨著菌體比生長(zhǎng)速率的增大迅速積累， 20 h 達(dá)到最大值190． 32mmol /L， 隨后 NH4 + 逐漸被消耗， 基本維持在150mmol /L。0 ～ 6h， 菌體不產(chǎn)酸， 發(fā)酵液的 pH 保持穩(wěn)定，不需流加氨水， 進(jìn)入對(duì)數(shù)期后， 菌體開始產(chǎn)酸需流加氨水來維持 pH 值，隨著氨水的補(bǔ)入， 發(fā)酵液中的NH4+ 累積濃度逐漸增大，當(dāng) NH4 + 濃度高于 170 mmol /L 時(shí)會(huì)嚴(yán)重抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)酸受阻 。由此可見，L-色氨酸發(fā)酵過程中 NH4 + 的積累主要表現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中后期，因此有必要考察 NH4 + 濃度對(duì) L-色氨酸發(fā)酵中后期的影響。
控制 NH4 + 濃度在 120 mmol /L 以下及在發(fā)酵 14 h 后向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加 0、2、5 g /L 的硫酸銨， 考察不同 NH4 + 濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和 L-色氨酸產(chǎn)量的影響( 圖 2) 。從圖 2 可以看出，與未添加硫酸銨相比，14 h 添加2 g /L 與 5 g /L 硫酸銨L-色氨酸發(fā)酵過程中 NH4 + 的最大累積濃度分別達(dá)到256． 67 mmol /L 和 327． 51 mmol /L，對(duì)菌體生長(zhǎng)和 L-色氨酸均有明顯的抑制作用， 且抑制程度隨著 NH4 + 濃度的增加而增強(qiáng)。其中硫酸銨添加量為 2 g /L 時(shí)，菌體生物量和 L-色氨酸產(chǎn)量分別下降23． 85% 和 17． 71% ; 硫酸銨添加量為 5g /L 時(shí)， 菌體生物量和 L-色氨酸產(chǎn)量?jī)H為 22． 39 g /L，20． 12 g /L，分別下降了 35． 01% 和 25． 73% 。
NH4+ 對(duì) L-色氨酸發(fā)酵過程的抑制還表現(xiàn)在使菌體過早的衰老、自溶， 未添加硫酸銨時(shí)，26 h 后菌體進(jìn)入穩(wěn)定期; 添加 2 g /L 硫酸銨時(shí)，24h 后菌體進(jìn)入穩(wěn)定期; 而添加 5 g /L 硫酸銨時(shí)，21 h 后菌體就基本就進(jìn)入穩(wěn)定期，25 h 后菌體生物量下降， 細(xì)胞開始自溶，進(jìn)入衰退期; 控制 NH4 + 濃度在 120 mmol /L 以下時(shí)， 菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)至 30 h，比生長(zhǎng)速率和比產(chǎn)酸速率增大，菌體生物量和 L-色氨酸產(chǎn)量分別提高 12．16% 和19． 80% 。
利用液相色譜法對(duì)不同 NH4 +濃度發(fā)酵液的有機(jī)酸組成進(jìn)行分析( 圖 3) 。隨著發(fā)酵液中 NH4 + 濃度的增大，L-色氨酸發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量均有不同程度的增加，但增幅不大。未添加硫酸銨時(shí)， L-色氨酸發(fā)酵過程中丙酮酸、乳酸、乙酸的累積濃度分別為 0． 04g /L 、0． 23g /L 和 2． 46g /L; 添加 2g /L硫酸銨時(shí)為 0． 06g /L、0． 42g /L 和 3． 06g /L; 添加 5g /L 時(shí)為0． 07g /L、0． 54g /L和 3． 31g /L; 控制 NH4 + 濃度在 120mmol /L 以下時(shí)為0． 21g /L、0． 03g /L 和 2． 23g /L。
在 30 L 自控發(fā)酵罐上進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，每隔 2 h測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖濃度( 圖4) 。測(cè)定結(jié)果表明，隨著NH4+ 濃度的增加， 菌體耗糖速率減慢。由此可見， 說明 NH4 + 影響大腸桿菌對(duì)糖類的代謝。
重組大腸桿菌高密度發(fā)酵技術(shù)已在生產(chǎn)實(shí)踐中得到了廣泛應(yīng)用，并取得一定成果，但是該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中也存在許多需要解決的問題， 其中最為嚴(yán)重的是培養(yǎng)過程中菌體過早的衰老、自溶、比活性較低， 這主要是由于細(xì)菌產(chǎn)生的有害代謝物對(duì)重組菌存在抑制作用。高濃度的 NH4 + 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，主要表現(xiàn)為 NH4 + 濃度增高所產(chǎn)生的毒化作用和 pH 值上升改變細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境這兩方面， pH 值的改變降低了胞外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的解離度和細(xì)胞膜的通透性，干擾了菌體的初級(jí)代謝，進(jìn)而影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。葉貴子等通過選育耐銨型產(chǎn)琥珀酸放線桿菌， 使得琥珀酸產(chǎn)量比出發(fā)菌提高180． 5% 。鄭夢(mèng)杰等通過檢測(cè)鏈霉菌發(fā)酵過程中相關(guān)酶的活力，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中的 NH4 + 通過作用于糖代謝過程中的多個(gè)位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞合成代謝的抑制， 總體致使 PP途徑減弱， NADPH 生成速率減慢， TCA 循環(huán)加強(qiáng)。
發(fā)酵生產(chǎn) L-色氨酸的代謝流量分析結(jié)果表明， NH4 + 濃度的增加，造成 EMP 途徑的代謝流量增加 7．31% ， PP 途徑的代謝流降低 7． 14% ， TCA 循環(huán)的代謝流量增加22． 04% 。PP 途徑流量減小，NADPH 生成速率減慢，TCA 循環(huán)加強(qiáng)， 能量代謝速率加快， 造成胞內(nèi) ATP 積累，ATP 積累至一定濃度時(shí)，可反饋抑制 EMP 途徑中某些酶的活性，降低糖的酵解速率， 從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和某些代謝產(chǎn)物的合成。
利用 NaOH 和氨水混合補(bǔ)料，控制 NH4 + 濃度在120 mmol /L 以下，解除了 NH4 + 對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成的抑制，使得菌體生物量和 L-色氨酸產(chǎn)量大幅提高，且實(shí)現(xiàn)了高密度發(fā)酵培養(yǎng)， 這對(duì)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn) L-色氨酸提供了理論依據(jù)并具有一定實(shí)用價(jià)值。