524-61-8 / 硫酸辛可尼丁的應用

背景及概述^[1]

金雞納樹皮中的一種生物堿。辛可寧的立體異構體。有左旋光性。熔點210℃。難溶于水，溶于乙醇。硫酸辛可尼丁三水物是針狀晶體。溶于水和乙醇。無水物熔點約240℃(分解)。與奎寧相像，具有抗瘧作用。可在金雞納樹皮提取液中分出奎寧后，母液以堿處理，析出生物堿，加入酒石酸使其成為難溶的酒石酸鹽分離而得。

應用

硫酸辛可尼丁對腫瘤細胞生長的影響，硫酸辛可尼丁可以促進腫瘤細胞凋亡，以抑制腫瘤細胞生長，促進腫瘤的早期凋亡，并增強了促進細胞凋亡因子的表達，抑制了抑制凋亡因子的表達。硫酸辛可尼丁有望于今后在抗腫瘤方面應用。

1.硫酸辛可尼丁對腫瘤細胞生長的影響：用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養基培養子宮頸癌細胞系HeLa細胞、人乳腺腺癌上皮細胞系MCF7細胞和人肺癌細胞系A549細胞系，分別以4600個/孔的細胞密度接種到96孔板，培養24小時(h)后，分別加入1，5，10，50，100，250μmol/L濃度的辛可寧丁，分別培養48h，72h和96h后用MTT法測細胞生長狀況，其結果顯示硫酸辛可尼丁有濃度依存性地抑制HeLa細胞的生長。

MTT法：每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，培養箱中孵育3小時后取出，棄去上清，每孔加150μl二甲基亞砜溶解甲瓚沉淀，用酶標儀在490nm下測定吸光度值。實驗結果表明硫酸辛可尼丁可以抑制HeLa細胞(A)，MCF7細胞(B)和A549細胞(C)，表明硫酸辛可尼丁有抗腫瘤活性。

2.早期細胞凋亡的檢測-流式細胞：為了研究辛可寧抑制腫瘤細胞生長的機制，進一步探討了它們對HeLa細胞的早期細胞凋亡的影響。方法如下：用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養基培養HeLa細胞，接種于6cm細胞培養皿，調整細胞密度，培養24h后，加硫酸辛可尼丁時細胞密度在40％左右，分別加入100，150，180μmol/L濃度的辛可寧，分別作用48h后用流式細胞術測定細胞早期凋亡。

流式細胞術：培養細胞與6cm細胞培養皿中，加辛可寧刺激后，收集細胞，PBS洗2遍，1500-2000rpm離心5min，棄去上清，加入BindingBuffer100μl，磷脂酰絲氨酸結合蛋白(AnnexinV)-FITC5μl，碘化丙啶(PI)5μl，室溫暗處反應30min后，加400μlBindingBuffer，上樣檢測細胞早期凋亡。結果顯示硫酸辛可尼丁提高了HeLa細胞的AnnexinV和PI的表達，表明硫酸辛可尼丁能促進腫瘤細胞的早期凋亡。

3.泛素化Akt(Ub-Akt)和磷酸化Akt(p-Akt)的檢測：

LPS可以促進Akt泛素化和磷酸化，為了探討硫酸辛可尼丁的作用途徑，我們研究了化合物能否阻止Akt的泛素化和磷酸化。用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養基培養HeLa細胞，接種于6cm細胞培養皿中，調整細胞密度，使加化合物時細胞密度達到70％-80％，加180μmol/L的硫酸辛可尼丁分別刺激1、2和3h。然后加20μg/ml的LPS刺激3h后，提取總蛋白。用ProteinASepharosebeads沉淀Akt蛋白，Westernblot法檢測泛素化Akt的變化，以β-actin作為內參蛋白。加180μmol/L的硫酸辛可尼丁分別刺激3、6、12和24h。然后加20μg/ml的LPS刺激3h后，提取總蛋白。用Westernblot法測定磷酸化Akt的變化，以β-actin作為內參蛋白。

Western：提取細胞總蛋白，應用BCA蛋白定量法得出提取蛋白的濃度，按每孔40μg上樣。吸取蛋白樣品，按1：4比例加入5×loadingbuffer，煮沸10min，上樣，跑SDS電泳，80V，20min，120V，1h。電泳結束后，用半干轉轉印槽于23V，轉印1h。取出PVDF膜，TBST洗6次，每次5min，5％脫脂奶粉封閉2h。轉入5％BSA稀釋的p-Akt(308/473)、Akt、泛素化抗體或β-actin抗體中，4℃搖過夜。第二天，取出PVDF膜，TBST洗膜后轉入5％脫脂牛奶稀釋的通用二抗中，孵育40min，TBST洗40-50min，加入eECL，反應1-2min，暗室曝光。結果顯示，硫酸辛可尼丁可以有效地阻止LPS引起的Akt的泛素化和磷酸化。

4.泛素化TAK1(Ub-TAK1)和磷酸化TAK1(p-TAK1)的檢測：

LPS可以促進TAK1泛素化和磷酸化，為了探討硫酸辛可尼丁的作用途徑，研究了化合物能否阻止TAK1的泛素化和磷酸化。用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養基培養HeLa細胞，接種于6cm細胞培養皿中，調整細胞密度，使加化合物時細胞密度達到70％-80％，加180μmol/L的硫酸辛可尼丁分別刺激3、6、12和24h。然后加1μg/ml的LPS刺激15min后，提取總蛋白。用ProteinASepharosebeads沉淀TAK1蛋白，Westernblot法檢測泛素化TAK1的變化，以β-actin作為內參蛋白。結果顯示，硫酸辛可尼丁可以有效地阻止LPS引起的TAK1的泛素化和磷酸化。

5.細胞凋亡相關因子的檢測(Bax/Bcl)：

探討化合物對細胞凋亡相關因子Bax和Bcl的表達。用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養基培養HeLa細胞(購自沈陽萬類生物科技有限公司)，接種于6cm細胞培養皿中，調整細胞密度，培養24h后，加辛可寧時細胞密度在40％左右。每皿細胞加入180μmol/L的辛可寧，分別刺激12h、24h、48h、72h、96h。提取細胞總蛋白，用Westernblot法檢測細胞凋亡相關因子Bax/Bcl的表達。

結果顯示從加硫酸辛可尼丁24h后Bax的表達有所提高，而Bcl的表達被抑制，48h后此現象更加明顯，Bax是凋亡促進蛋白，而Bcl是凋亡抑制蛋白，此結果進一步支持硫酸辛可尼丁促進了細胞凋亡。

主要參考資料

[1] 簡明精細化工大辭典

[2] CN201710142634.4硫酸辛可尼丁在制備抗腫瘤藥物的用途