37326-33-3 / 透明質(zhì)酸酶純化方案

透明質(zhì)酸酶也叫玻璃酸酶。其可以降低組織黏度，提高毛細(xì)血管和組織的通透性，加速細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的擴(kuò)散，是一種重要的藥物擴(kuò)散劑。牛羊睪丸中提取的透明質(zhì)酸酶與頂體酶混合存在。目前國(guó)內(nèi)提純?cè)撁钢饕莻鹘y(tǒng)的鹽析方法，提純純度不高。生物分離介質(zhì)作為純化技術(shù)的新技術(shù)和新趨勢(shì)，不僅生物相容性好，而且提純精度高，可以達(dá)到較好的分離效果。

牛羊睪丸中的透明質(zhì)酸酶分子量是6.1×104，為酸性蛋白酶，pI＜7.0。最適pH值4.0～7.5。頂體蛋白酶是中性蛋白酶，pI=7.0。可以用DEAE Bio-sep FF弱陰離子交換介質(zhì)進(jìn)行純化。在pH=7.0時(shí)透明質(zhì)酸酶帶負(fù)電荷，頂體蛋白酶不帶電荷。頂體蛋白酶不帶電荷，不被介質(zhì)吸附，在上樣過(guò)程中流穿出來(lái)。透明質(zhì)酸酶帶負(fù)電荷被介質(zhì)吸附，再用高鹽濃度的緩沖液洗脫下來(lái)，從而達(dá)到兩個(gè)酶分離純化的目的。

純化流程

1.準(zhǔn)備填料。此填料的載量為80mg/ml(BSA)，粒徑50~160um，流速450~750cm/h，耐壓0.3Mpa。建議上樣量控制在20~40mg/ml，流量（ml/min）計(jì)算為：450×柱子橫截面積÷60，建議不要超過(guò)此值。（粒徑、強(qiáng)度、載量可以調(diào)整和制定）。

2.裝柱。把填料裝到柱子，注意不要有氣泡，柱子徑高比控制在1:10~1:5，然后用蒸餾水把貯存液清洗干凈，一般走8~10個(gè)柱體積。

3.平衡。用緩沖液20mM Tris-HCl，pH7.0平衡柱子，直到流出液的pH和電導(dǎo)穩(wěn)定，一般走10~15個(gè)柱體積。

4.樣品的準(zhǔn)備。可以把預(yù)處理后的樣品，經(jīng)過(guò)超濾、透析、G-25脫鹽等置換成和平衡緩沖液一樣的體系。

5.上樣。根據(jù)填料體積確定上樣量，一般為介質(zhì)體積的1/30，用合適的流速把樣品流經(jīng)柱子，收集流穿液。上樣后，透明質(zhì)酸酶吸附在柱子上，而頂體蛋白酶直接流傳下來(lái)。

6.淋洗。用平衡液流經(jīng)柱子，直到pH和電導(dǎo)保持不變。

7.洗雜。用20mM Tris-HCl緩沖溶液加5mM氯化鈉，pH7.0，流經(jīng)柱子，直到pH和電導(dǎo)保持不變。

8.洗脫。用20mM Tris-HCl緩沖溶液加上不同濃度的氯化鈉200mM、250 mM、300 mM、400 mM、500 mM、1M、2M，pH7.0分別流經(jīng)柱子，每個(gè)洗脫液洗8個(gè)柱體積，分別收集，統(tǒng)一分別檢測(cè)，確定哪個(gè)濃度的氯化鈉洗脫更為合適。

9.柱子的再生處理。洗脫完后，先用2M的氯化鈉洗3~5個(gè)柱體積，再用0.1M氫氧化鈉洗3個(gè)柱體積，然后水洗至中性，再用20%乙醇過(guò)柱子。將填料保存于20%乙醇溶液。