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β-半乳糖苷酶是一種重要的糖苷水解酶，在乳制品、食品和制藥行業具有潛在應用。該酶由細菌和酵母在細胞內環境中產生。
β-半乳糖苷酶的活性端通過“淺層”與“深層”結合基質來催化水解雙糖。一價的鉀離子（K +），以及二價的鎂離子（鎂2 +）需要酶的最佳活性。以β-核苷間鍵為基質經由谷氨酸側鏈上的羧基終端裂解而成。 在大腸桿菌中，谷氨酸-461被認為是取代反應的親核試劑。然而，現在已經知道谷氨酸-461是一種酸[催化劑]。相反的，谷氨酸-537為實際的親核試劑，他是結合到半乳糖的中間體。
在人類中，是由Glu-268扮演水解反應的親合試劑。
β-半乳糖苷酶所催化的反應
β-半乳糖苷酶檢測常用于遺傳學、分子生物學，以及其他生命科學。可用于藍/白篩檢測中，有活性的酶可以用X-gal來進行檢測，會在裂解β-半乳糖苷后形成一個深藍色的產物5-溴-4-淀藍，并且容易辨識和量化。它的生產可以透過非水解性誘導結構異構物中的異乳糖─IPTG，從lac操作者中結合并釋放lac操縱子，從而使轉錄起始端繼續進行。
因為他的高表現性質以及它在衰老細胞中的溶酶體累積的特性。盡管有其局限性，它可被當作一個老化的標志物，借由進行體內和體外在定性和定量可用以測定老化程度。