54827-17-7 / TMB顯色液_使用說明書

TMB顯色液是一種采用了最新單一溶液TMB顯色技術，通過辣根過氧化物酶(HRP)催化TMB顯色，用于ELISA等的顯色液。本顯色液也可以用于檢測血液或血紅蛋白等樣品中的過氧化物酶含量。

通常的TMB顯色試劑由多個組份組成，必須在使用前進行配制，并且容易產生沉淀，使用相對不太方
便，并且也容易導致檢測結果不太穩定。本TMB顯色液采用了最新的TMB顯色技術，把所有的相關試劑全部配制在一個溶液中，僅由單一溶液組成，簡化了操作步驟，并且使檢測結果更加穩定可靠。

TMB，即3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，是辣根過氧化物酶的常用底物。在辣根過氧化物酶或其他適當過氧化物酶的催化下，TMB會產生可溶性藍色產物。藍色產物通常可以在370nm或620-650nm測定吸光度。
辣根過氧化物酶催化TMB顯藍色后可以使用2M H2SO4終止反應。加入硫酸后，溶液呈黃色，此時可以在450nm測定吸光度。

圖1為TMB顯色反應

背景知識
目前酶免疫分析（EIA)技術，已被廣泛應用于抗原，半抗原或抗體的定量或定性檢測分析。辣根過氧化物酶（HRP)及其偶聯物是酶聯免疫分析技術中常用的一種酶，由于3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（TMB)在HRP的顯色反應體系中，比其它色原具有更高的靈敏度且無致癌性而被廣泛應用。TMB主要應用于酶聯免疫吸附實驗（ELISA)，免疫斑點雜交或者免疫組化以及氯和過氧化氫的檢測分析。為了滿足不同的試劑盒產品研發與生產以及科研需求，本公司專門研制了針對不同類型的基于HRP的免疫分析用TMB顯色液。

產品特點

• 即用型：無需混合，方便快捷，減少誤差
• 靈敏度高：不低于A、B液
• 穩定性好：2-8℃保存，有效期不低于36個月；顯色終止后讀數穩定
• 背景低：底物溶液在650nm檢測時檢測OD值小于0.04
• 質量可靠：產品批間差異小
• 外觀：本試劑一般情況下為無色，有時略顯淺藍色或淺黃色

使用方法
用適當的干凈容器（用純凈水反復沖洗），倒出適量的單組分TMB顯色液，待達到室溫后即可使用。
加液：加完HRP結合物并孵育一定時間后，用適當洗滌液洗板3-5次，每孔加TMB顯色液100ul。 根據個人實驗需要，在室溫（15-25℃）或37℃下避光溫育10-30分鐘或更長時間，直至顯色至預期深淺。
終止：加入等體積的1M 鹽酸或硫酸溶液終止反應，孔中反應液由藍色變為黃色。
讀數：終止反應后30分鐘內在450nm處測定吸光值。
注意：如果出現高的反應背景或沉淀，表明TMB底物反應過于強烈。為了避免產生沉淀，可在終止后馬上讀數；或者進一步稀釋一抗和/或HRP結合物。

使用說明
1. 對于ELSIA檢測：

1. 參考ELISA試劑盒的實驗步驟，在與辣根過氧化物酶標記的抗體孵育后，用適當洗滌液洗滌3-5次，每次3-5分鐘。
2. 洗滌完畢后，去除洗滌液，加入200微升TMB顯色液。
3. 室溫避光孵育3-30分鐘或更長時間(可長達24小時)，直至顯色至預期深淺。
4. 直接在370nm或620-650nm測定吸光度。或加入50微升2M H2SO4終止反應，隨后在450nm測定吸光度。

2. 對于在96孔板內進行的其他適當檢測 (例如檢測組織或細胞樣品內源性的過氧化物酶)：

1. 直接在96孔板內每孔加入10-20微升樣品。
2. 加入200微升TMB顯色液。
3. 室溫避光孵育3-30分鐘或更長時間(可長達24小時)，直至顯色至預期深淺。
4. 直接在370nm或620-650nm測定吸光度。或加入50微升2M H2SO4終止反應，隨后在450nm測定吸光 度。

常見問題
1. 背景顯色太深。

• 如果背景(沒有樣品的對照)顯色太深，一方面需考慮使用適當的封閉液進行封閉，例如選購適當的封閉液或使用和一抗相同來源的血清(10%)進行封閉。另一方面，請選購經過適當吸附的二抗，以減小二抗的非特異性吸附。
• 可以考慮縮短顯色時間，或降低二抗濃度。另外，選擇適當強度的洗滌液，或延長洗滌時間也會有所幫助。

2. 沒有顯色或顯色太弱。

• 適當提高一抗或二抗的濃度。檢測二抗效果，滴一滴稀釋二抗在離心管內，檢測二抗是否可以被正常顯色。
• 可以考慮使用更加靈敏的放大檢測體系，例如使用生物素檢測體系。
• 可以適當延長顯色時間。
• 如果上述改進不能獲得預期效果，可以考慮更換效果更好的一抗或ELISA試劑盒。