11032-49-8 / 維生素K2的制備方法

背景及概述^[1]

維生素K2生物合成途徑是由異戊二烯側鏈合成途徑與萘醌骨架合成途徑組合而成的。維生素K2具有良好的促進凝血、預防和治療骨質疏松的功效，同時還能改善動脈硬化，對肝癌和白血病也有預防和治療作用，早在1995年日本已經將維生素K2作為骨質疏松治療藥物。

制備^[1-2]

報道一、

（1）以黃桿菌1.6859為出發菌株，將黃桿菌培養在如下平板培養基（g/L）中進行活化：葡萄糖15g/L，馬鈴薯浸出液180g/L，甘油5g/L，瓊脂20g/L，PH自然；溫度37℃，培養時間3天；

（2）將活化好的菌種用無菌生理鹽水稀釋100倍，達到菌液中菌體濃度為每毫升含107個細胞，用微量移液器取該菌懸液0.1mL均勻涂布于無菌平皿上，置于超凈工作臺上自然風干，將平皿放入低能離子注入機的靶室中進行N+注入，注入能量為15kev，劑量為2.0×1015N+/cm2；同時以真空環境下未接受離子注入的樣品作為對照；離子注入輻照后，在超凈工作臺上用1mL無菌生理鹽水分別洗脫處理樣品和對照樣品，將洗脫得到的菌液用微量移液器分別取0.1mL菌液均勻涂布在初篩平板培養基（葡萄糖15g/L，馬鈴薯浸出液180g/L，甘油5g/L，瓊脂20g/L，1,4?二羥基?2?萘甲酸80mg/L）上培養，在35℃下倒置培養3天，待長出單菌落后進行菌落計數并挑取生長速度快，直徑大的菌落，接入發酵培養基（甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物1.5g/L，MgSO40.3g/L，K2HPO44.5g/L，NaCl3g/L）上搖瓶發酵，將維生素K2產量高的菌株移至斜面培養基保藏；

（3）將上步驟獲得高產量黃桿菌菌液取0.1mL于無菌空平皿中涂布均勻，吹干；將平皿放入低溫空氣等離子體放電裝置中，抽真空到30Pa時開始等離子體放電，電源為13.56MHz的射頻電源，功率為360W，放電20分鐘后放入過濾后的無菌空氣恢復柜內壓力，取出樣品；同時以真空條件下不接受等離子體放電處理的真空對照和未處理對照；在超凈工作臺上用1mL無菌生理鹽水分別洗脫處理樣品和對照樣品，將洗脫得到的菌液用微量移液器分別取0.1mL菌液均勻涂布在初篩平板培養基（葡萄糖15g/L，馬鈴薯浸出液180g/L，甘油5g/L，瓊脂20g/L，1,4?二羥基?2?萘甲酸80mg/L）上培養，在35℃下倒置培養3天，待長出單菌落后進行菌落計數并挑取生長速度快，直徑大的菌落，接入發酵培養基（甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物1.5g/L，MgSO40.3g/L，K2HPO44.5g/L，NaCl3g/L）上搖瓶發酵；反復步驟（2）和步驟（3）2次后，獲得黃桿菌菌株維生素K2產量提高80%；

（4）將步驟（3）獲得的黃桿菌菌株接入種子培養基（甘油10g/L，蛋白胨20g/L，MgSO41.5g/L，K2HPO41.5g/L）中在35℃培養1天，按接種量5%接入發酵培養基，并在發酵培養基中添加2%表面活性劑POE，胞內維生素K2可溶至胞外；然后搖瓶轉速200轉，35℃培養3天，維生素K2總產量提高150%。

報道二、

（1）取黃桿菌HNA12-D接種于斜面培養基中，30℃下培養24小時進行活化，然后置于4℃下保藏2天，獲得活化的黃桿菌HNA12-D的斜面保藏菌，所述斜面培養基的配方為：甘油8g/L，蛋白胨8g/L，酵母提取物1.5g/L，氯化鈉2g/L，磷酸氫二鉀2g/L，硫酸鎂0.1g/L，瓊脂20g/L；

（2）取上述斜面保藏菌接種于種瓶培養基中，每50mL種瓶培養基接種0.1立方厘米的斜面保藏菌，在30℃下搖瓶培養24小時，搖瓶轉速120rpm，獲得種瓶培養物，所述種瓶培養基配方為：甘油4g/L，蛋白胨4g/L，酵母提取物1.5g/L，氯化鈉2g/L，磷酸氫二鉀2g/L，硫酸鎂0.05g/L；

（3）取種瓶培養物接種于發酵培養基中，置于28℃下發酵培養120小時，獲得發酵液，每100ml發酵培養基接種4ml的種瓶培養物，發酵培養期間每隔20小時補加營養物質的重量百分比分別為：甘油0.05%、蛋白胨0.05%以及異戊二烯0.005%，發酵培養基的配方為：在上述種瓶培養基中添加聚氧乙烯油醚0.5g/L；

（4）取上述發酵液，加入明礬進行絮凝，離心，收集沉淀，獲得濕菌體；

（5）將濕菌體放在-15℃低溫下冷凍3分鐘，然后在室溫中融化；

（6）重復上述步驟（5）2次，使濕菌體的細胞經反復凍融而破碎，獲得破碎菌體；

（7）純化：

a、用20mL正己烷對上述破碎菌體進行萃取，提取有機層并旋轉蒸發，得到維生素K2粗品；

b、取維生素K2粗品，溶于5mL無水乙醇中，用溶脹好的HZ816樹脂裝柱30mL，連接紫外檢測器和收集器，以3BV/h的流速將維生素K2粗品溶液倒入層析柱上，然后用100%工業乙醇對樹脂進行洗脫，洗脫至紫外檢測器所示數值恒定不變，此時大部分雜質基本被洗脫干凈了，再用丙酮溶液將維生素K2洗脫下來，獲得的丙酮洗脫液置于0℃下靜置，即得到維生素K2粗分品；

c、將適量的硅膠裝入層析柱中，硅膠裝入層析柱的高徑（直徑）比為3：1，取維生素K2粗分品溶于體積比為10：1的正己烷和乙酸乙酯混合液的洗脫劑中，從層析柱頂端倒入，在柱子下端收集流出液，其中洗脫的流速為0.5BV/h；

（8）將上述純品提取液干燥，獲得維生素K2的純品。

參考文獻

[1][中國發明]CN201310280268.0一種利用黃桿菌高效生產維生素K2的方法

[2][中國發明,中國發明授權]CN201310521459.1一種維生素K2及其制備方法