12650-88-3 / 溶菌酶的多種提取方法

【背景及概述】^{[1] [2][3]}

對微生物產生溶菌酶的研究，最早可追溯于Nicoile 1907 年發表枯草芽孢桿菌溶解因子的報告開始。從20 世紀中期以來，研究較多的有擬內串生孢霉(Chalarosis)、球孢鏈霉菌(S trep tomy ces globisporus)、灰色鏈霉菌(S trep tomy ces griseus)、蠟狀芽孢桿菌(Baci lus cereus)、丙酮丁酸梭菌(Clostrid iumacetobuty l icum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lacti s)、肺炎鏈球菌(S .pneumoniae)以及幾種細菌噬菌體等產生的溶菌酶，日本和德國在微生物溶菌酶的研究較多，國內山東大學微生物國家重點實驗室在這方面做了較多工作。對溶菌酶的研究始于20世紀初，人們發現人的唾液、眼淚中存在有溶解細菌細胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名為溶菌酶。1937年Abraham和Robinson從卵蛋白中分離出溶菌酶晶體，揭開了研究溶菌酶的歷史篇章。它廣泛存在于鳥類、家禽的蛋清中和哺乳動物的淚液、唾液、血漿、乳汁、胎盤以及體液、組織細胞內，其中在蛋清中含量最豐富。在一些植物體如卷心菜、蘿卜、無花果和微生物體內也存在溶菌酶，只是含量差異較大。

最新研究表明將溶菌酶固定化在食品包裝材料上，生產出有抗菌功效的食品包裝材料，以達到抗菌保鮮功能；將溶菌酶固定化在HEPA上，作為空調的空氣凈化系統，使其具有高效除塵和殺菌兩大功能。當空氣通過濾網時，先濾集捕捉塵粒和細菌，然后將捕捉到的細菌殺滅；用溶菌酶非專一性地降解海洋生物高分子殼聚糖，使其成為能被人體吸收的低分子量具有獨特生理活性和功能性質的低聚殼聚糖。

【理化性質與結構】^[2][3]

溶菌酶(Lysozyme)是水解酶的一種，又稱為胞壁質酶(muramidase)或N-乙酰胞壁質肽聚糖水解酶(Nacetylmuramideglycanohydrlase)。溶菌酶是一種堿性蛋白質，在酸性環境下，溶菌酶對熱的穩定性很強，pH值3.0時96℃加熱處理15min仍能保持87%的酶活性。在自然條件下，大多數溶菌酶化學性質穩定，即使當pH值在1.2～11.3范圍內劇烈變化，其酶結構仍維持不變，活性也不受影響。但堿很容易使酶活性遭到破壞，當處于堿性pH值范圍時，溶菌酶的熱穩定性就很差。溶菌酶在干燥條件下，室溫可長期保存，其純品為白色或微黃色結晶體或無定型粉末，無嗅，味甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚。其分子結構如下：

【分類】^[2]

溶菌酶的底物特異性很強，不同來源溶菌酶作用的底物不同。按溶菌酶的來源可分為蛋清溶菌酶、動物溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和細菌噬菌體溶菌酶按作用細胞壁不同分為細菌細胞壁溶菌酶和真菌細胞壁溶菌酶。細菌細胞壁溶菌酶又細分為兩種，一種是作用于β -1，4糖苷鍵的細胞壁溶解酶，另一種是作用于肽鏈尾端和酰胺部分的細胞壁溶解酶。真菌細胞壁溶菌酶包括酵母菌細胞壁溶解酶和霉菌細胞壁溶解酶。溶菌酶大體分為5種：(1)內N-乙酰己糖胺酶，此酶同于雞蛋清溶菌酶，破壞細菌細胞壁肽聚糖中的β -1.4 糖苷鍵。(2)酰胺酶，切斷細菌細胞壁肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖胺與肽尾之間的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸鍵。(3)內肽酶，使肽尾及肽橋內的肽鍵斷裂。(4)β -1.3、β -1.6葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母細胞的細胞壁。(5)殼多糖酶，這是分解霉菌細胞壁的一種溶菌

【適應癥】^[4]

溶菌酶臨床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔潰瘍、水痘、帶狀皰疹、扁平疣、哮喘性氣管炎、支氣管哮喘、潰瘍性結腸炎、腮腺炎等。

【規格及用量】 ^[4]

1. 腸溶片：10mg。口服，每日3次，每次3～5片。治療水痘，10mg/(kg·d)，分3～4次服。

2. 口含片：每片20mg，每日4～6次，每次 1片。

3. 外用，用生理鹽水或注射用水或甘油配成1%～2%溶液外擦，或直接噴撒藥粉。

【藥理作用】

溶菌酶系從鮮雞蛋清中提取的一種能分解粘多糖的多肽酶。能使各種微生物細胞壁中的不溶性粘多糖類轉變為可溶性粘肽類而發揮抗菌作用，在細胞內對被吞噬的病原菌起破壞作用。具有抗菌、抗病毒、止血消腫、清除局部壞死組織、痰液變稀、加強組織功能恢復等作用。

【注意事項】^[4]

肌注可發生過敏反應而致死，3歲以下小兒較易出現，故一般不采用注射給藥。溶液宜新鮮配制。口服偶有過敏。

【其他應用】^[2]

1. 在食品工業中的應用

溶菌酶是一種無毒、無副作用的蛋白質，又具有溶菌作用，因此可用作食品防腐劑。目前已廣泛應用于水產品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及飲料中的防腐，溶菌酶屬于冷殺菌，在殺菌防腐過程中不需加熱，因而避免了高溫殺菌對食品風味的破壞作用，尤其對熱敏感的物質更具有重要意義。還可以添加到乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制腸道中腐敗微生物的生存，同時直接或間接促進腸道中雙歧桿菌的增殖。此外，還能利用溶菌酶生產酵母浸膏和核酸類調味品。

2. 在生物工程研究中的應用

隨著生物科學的發展，溶菌酶已成為基因工程及酶工程中必不可少的工具酶，用以制造和提取菌體內的活性物質如核酸、酶及活性多肽等，利用其專一性水解細胞壁的特點，有助于人們對細胞壁細微結構的認識，為我們深入研究細胞壁的構造打下了堅實的基礎，同時作為是一種重要的破壁酶，在原生質體的制備方面提供了新的方法，因此溶菌酶被廣泛應用于生物技術、生物工程中。

3. 溶菌酶在畜禽飼料中的應用

1）用作飼料防腐劑和殺菌劑：由于溶菌酶本身是一種天然蛋白質，無毒性，是一種安全性高的飼料酶，它能專一性的作用于目的微生物的細胞壁，而不能作用于其它物質。該酶對革蘭氏陽性菌、枯草桿菌、耐輻射微球菌有很強分解作用；對大腸桿菌、普通變形菌和副溶血弧菌等革蘭氏陰性菌等也有一定的殺滅作用；與聚合磷酸鹽和甘氨酸等配合使用，具有良好的防腐作用。在飼料中添加溶菌酶可防止霉變，延長飼料的貯存期，減少不必要損耗。

2）具有防治仔豬腹瀉的作用：溶菌酶對防治仔豬腹瀉有顯著作用，可達到抗生素的使用效果，治愈率達80%以上。溶菌酶與免疫球蛋白的功能緊密聯系體內溶菌酶主要來自嗜中性白細胞、單核細胞及吞噬細胞溶酶體，可進入機體補體系統并增強抗體活性，從而殺滅有害微生物，因此溶菌酶對引起仔豬腹瀉的埃希氏大腸桿菌和輪狀病毒都具有較強的抑制作用。

【提取】

1. 直接結晶法

此法操作簡單，成本低，但不能用以分離微量的溶菌酶。

2. 親和色譜法

此法分離提純的倍數較高，質量較好，且可廣泛應用于各種來源的溶解酶，用于濃縮和精制微量的溶解酶。但由于親和吸附劑的制作復雜，限制了它在工業上的大規模利用。

3. 離子交換法( Ion- exchange chromatography)

利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結合力的差異進行物質分離的操作技術，由于具有簡便、高效、成本低，且可自動化連續操作的優點，因此一直以來都是溶菌酶生產所常用的方法。常用的離子交換劑有Duolite- 464、羧酸纖維素( PC) 、羧甲基纖維素( CMC) 和羧甲基瓊脂糖等。此法具有簡便、高效、成本低、且可自動化連續操作的優點。

4. 超濾與親和色譜法結合

這是近年來開發的新方法。首先用超濾除去大部分雜蛋白，保留溶解酶，但此時它還是粗酶，再用親和色譜法得到精制產品。

【制備】

1. 天然資源的溶菌酶的制備

1）雞蛋清溶菌酶的制備

雞蛋清中溶菌酶的含量約為3.5 %，是提取溶菌酶的方便來源。但不同產地的雞蛋，其蛋清中溶菌酶的含量也有所不同。工業上多采用直接結晶法、親和色譜法、離子交換法、超濾與親和色譜聯合使用等方法生產溶菌酶。采用控制溫度、調酸和加鹽的分離純化工藝將溶菌酶分離，之后利用超濾和噴霧干燥方法制成產品，產品活力達11 000 U/mg。利用親和沉淀從蛋清中分離溶菌酶也是溶菌酶制備研究的一個熱點。

2）蘿卜溶菌酶的制備

國內有人在對華南地區50 多科120 多種植物進行普查中，發現十字花科蘿卜葉中溶菌酶含量最高，且發現蘿卜溶菌酶的耐熱性、耐酸性均優于雞蛋清溶菌酶。進一步研究發現，該酶的抑菌效果與現在普遍生產和應用的雞蛋清溶菌酶有所不同。該酶不但對白色葡萄球菌等3 種革蘭氏陽性菌，而且對大腸桿菌等6種格蘭氏陰性菌及酵母、毛霉等5 種真菌具有不同程度的抑制作用，對另外參試的白菜軟腐病等7 種植物病原細菌、真菌及煙蟲和小菜蛾兩種昆蟲都有抑殺作用。

蘿卜溶菌酶抑菌的廣譜性和較強的抑菌能力，以及原料成本低廉等特點，都為蘿卜溶菌酶提供了良好的應用前景。

3）馬奶溶菌酶的制備

將蒙古馬奶經過硫酸銨沉淀，乳清蛋白脫鹽，DEAE - Sephadex A- 25，Sephadex G- 100，CMSephadexC- 25 柱層析分離得到馬奶溶菌酶，產率為38 mg/L馬奶。

3. 利用基因工程技術制備溶菌酶

以噬菌體T7DNA 為模板，PCR 擴增T7 溶菌酶基因，插入pBluescript SK 載體。DNA 序列分析表明，克隆的T7 溶菌酶基因和已報道的序列無水平上的差異。將T7 溶菌酶基因分別拼接在煙草病原相關蛋白( PRlb) 信號肽碼序列的3’末端和馬鈴薯卷葉病毒外殼蛋白( PLRV CP) 基因靠近3’末端處，構建成兩個融合蛋白基因。將T7 溶菌酶及其融合蛋白基因插入大腸桿菌表達載體pBV221，實現T7 溶菌酶基因在大腸桿菌中的高效表達，其產物的表達量占菌體可溶性蛋白的20 % 以上。

【主要參考資料】

[1] 曹濤, 劉同軍, 王艷君. 微生物溶菌酶的研究及應用[J]. 中國調味品, 2011, 36(3): 23-26.

[2] 陳艷, 江明鋒, 葉煜輝, 等. 溶菌酶的研究進展[J]. 生物學雜誌, 2009, 26(2): 64-66.

[3] 李鶴, 馬力, 王維香. 溶菌酶的研究現狀[J]. 食品研究與開發, 2008 (1): 182-185.

[4] 臨床常用藥物