132127-34-5 / (3R,4S)-3-羥基-4-苯基-2-氮雜環丁酮的制備

背景及概述^[1]

(3R,4S)-3-羥基-4-苯基-2-氮雜環丁酮，簡稱(-)β-內酰胺，它是一種非常具有潛力的手性藥物中間體，它有兩種異構體即（3R,4S）構型和（3S,4R），其中（3R,4S）構型的異構體的衍生物紫杉醇側鏈C-13是制備癌癥臨床化療最具應用前景的新藥之一多西紫杉醇的重要手性前體。

(3R,4S)-3-羥基-4-苯基-2-氮雜環丁酮的制備

一種大豆慢生根瘤菌全細胞拆分3-羥基-4-苯基-2-氮雜環丁酮。該方法包括如下步驟：

（1）菌種選擇：選用大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）作為菌種，菌種保藏號為CGMCC No.1.2550；該菌種保藏于-80℃；

（2）發酵液制備：將所述的大豆慢生根瘤菌菌種以0.1%～0.5%的體積比接種到根瘤菌培養基中，20℃～30℃，220rpm振蕩培養96～168h；

根瘤菌液體發酵培養基：酵母提取物1.0g，甘露醇10.0g，土壤提取液200ml，蒸餾水800ml，pH7.2；

其中土壤提取液：25g土壤，加去離子水100ml，105kPa蒸煮1小時，過濾后加水補足到蒸煮前體積；

具體制備方法為：將酵母提取物、甘露醇、土壤提取液溶于去離子水，以NaOH調PH 值至7.2，于121kPa滅菌20min，得到所述的根瘤菌發酵培養基；

（3）菌體收集：將培養得到的菌體發酵液與pH值為7.0的磷酸緩沖液按照一定比例充分混合，得到稀釋發酵液；然后在8000～11000rpm轉速下離心10～15min，收集菌體沉淀；再次用pH值為7.0磷酸鹽緩沖液進行洗滌處理，離心后回收得到濕菌體，收集濕菌體作為生物催化劑使用；

所述的pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液由0.05mol/l的Na₂HPO₄溶液和0.05mol/l的 NaH₂PO₄溶液混合而成，其體積比為7:3。

（4）生物拆分反應：將所述的濕菌體與1～10g/L消旋體β-內酰胺溶液混合，得到菌體混合液，其中500ul反應體系中包含60mg濕菌體；將所述的菌體混合液進行振蕩培養，得到反應液；所述的消旋體β-內酰胺溶液為消旋體β-內酰胺與通用緩沖液，經過一定時間的超聲處理后制得；

所述的不同pH值的通用緩沖液為Tris50mM；Boric acid 50mM；檸檬酸33mM； Na₃PO₄50mM。用HCl，NaOH調pH3～12。

所述的振蕩培養的溫度為25℃～50℃，pH值5.0～10.0條件下，轉速為200～ 220rpm，時間為3h～24h；

（5）樣品分離：將所述的振蕩后的菌液進行離心處理，轉速為8000～12000rpm，時間為5～10min，得到上清液，即為所述的（-）β-內酰胺樣品。

（6）HPLC測定：取500μL所述的（-）β-內酰胺樣品與200μL乙酸乙酯充分震蕩萃取，使目標產物溶解于乙酸乙酯；再取10μL所述的溶有目標產物的乙酸乙酯進樣，利用手性 HPLC測定（+）β-內酰胺及（-）β-內酰胺的含量，計算得出ee值和（-）β-內酰胺的產率。

（7）以上所述的消旋體β-內酰胺為3-羥基-4-苯基-2-氮雜環丁酮或3-乙酰氧基- 4-苯基-2-氮雜環丁酮。

（8）對應于步驟（7）中的全細胞拆分后所得(-)β-內酰胺分別為(3R,4S)-3-羥基- 4-苯基-2-氮雜環丁酮或（3R,4S）3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮雜環丁酮。

（9）3-羥基-4-苯基-2-氮雜環丁酮HPLC檢測條件：色譜柱型號為Daicel公司 Chiralpark AS-H(250×4.6mm)；以大賽璐AS-H手性柱作為固定相，100%乙腈，流速0.6ml/ min，檢測波長210nm。

（10）3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮雜環丁酮HPLC檢測條件：色譜柱型號為Daicel公司Chiralpark AS-H(250×4.6mm)；以大賽璐AS-H手性柱作為固定相，100%乙腈，流速0.4ml/ min，檢測波長210nm。

[1] [中國發明,中國發明授權] CN201410081161.8 一種以大豆慢生根瘤菌全細胞拆分消旋體β-內酰胺的方法【授權】