1492-24-6 / L-2-氨基丁酸的生物制備方法

背景技術

L-2-氨基丁酸是抑制人體神經信息傳遞的天然氨基酸，作為重要的化工原料和醫藥中間體，已被廣泛應用于藥物合成。L-2-氨基丁酸是合成新型抗癲癇藥左乙拉西坦的主要生產原料，也是合成抑菌抗結核藥乙胺丁醇鹽酸鹽的關鍵手性前體；乙胺丁醇也是多種手性藥物的手性中間體。

受技術和成本的限制，我國L-2-氨基丁酸的產量不能滿足國內和外貿出口的需求。L-2-氨基丁酸的制備方法已有化學法和生物方法，傳統的化學法不論是有機合成或化學拆分均因生產成本高而失去競爭力。生物方法中因酶催化方法制備方法效率高，專一性強而得到廣泛的應用。在酶法制備L-2-氨基丁酸的研究中，轉氨酶法和脫氫酶法是目前報道較多的方法。轉氨酶法中最為典型的是Fotheringham等在Rozzell等人研究的基礎上,開發的以L-蘇氨酸為原料，建立的三酶催化體系制備L-2-氨基丁酸的方法，其三酶體系為蘇氨酸脫氨酶、芳香氨基酸轉氨酶和乙酰乳酸合成酶。但該法生產L-2-氨基丁酸的轉化率只有54%，濃度只有20克/升左右，而且轉化時產生一定量的副產物NH3, L-丙氨酸和3-羥基-2-丁酮，產品分離純化困難，質量難以提高。

脫氫酶法例如中國發明專利ZL201010146920.6，報道了以L-蘇氨酸為原料，建立的三酶催化體系制備L-2-氨基丁酸的方法，其三酶體系為以L-蘇氨酸為原料，先由蘇氨酸脫氨酶轉化成2- 丁酮酸，再由亮氨酸脫氫酶2- 丁酮酸合成L-2-氨基丁酸，反應中加入用于再生輔酶的甲酸脫氫酶。三種酶的加入總量為0.5~5克/升，底物L-蘇氨酸的加入量為10~100克/升，緩沖液pH值為7.0~9.0的磷酸鹽溶液，調節反應液的pH值所用的溶液為濃氨水，溫度為15?40°C ;時間為3?48小時；反應為一鍋法。但該發明方法中，所述三種酶均需要克隆表達后經細胞破碎，冷凍干燥得到凍干粉的酶制劑，增加了催化劑的成本；反應體系需要以磷酸鹽作為緩沖體系，增加了原料成本.該工藝反應后處理只是初步處理，按照該工藝產品中的無機鹽及甲酸銨等雜質難以達到原料藥的要求。因此，有必要進一步開發一種高效，低成本，且易于產業化大生產的酶催化制備L-2-氨基丁酸的新方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種改進的L-2-氨基丁酸的生物制備方法，該方法高效，成本低，易于產業化生產。

為解決以上技術問題，本發明采取如下技術方案:一種L-2-氨基丁酸的生物制備方法，其以L-蘇氨酸為原料，使L-蘇氨酸在水中、在L-蘇氨酸脫氨酶和具有亮氨酸脫氫酶和輔酶再生功能的全細胞的催化作用下，在溫度15°C?50°C下攪拌反應得到L-2-氨基丁酸。根據本發明的進一步實施方案:所述蘇氨酸脫氨酶和全細胞的加入總量為0.5^70克/升水，L-蘇氨酸的加入量為1(Γ130克/升水。優選地，所述蘇氨酸脫氨酶和全細胞的加入量分別為L-蘇氨酸加入量的0.39~0.6%和25 °~70%。

優選地，使反應在溫度25°C?40°C下進行；反應的時間為5?30小時。

根據本發明的一個方面，所述方法還使得所述反應在輔酶磷酸吡哆醛(PLP)的存在下進行，磷酸吡哆醛的加入量為L-蘇氨酸加入量的0.01%?0.05%。

根據本發明的又一方面，所述方法還使得所述反應在甲酸銨的存在下進行，甲酸銨的加入量為L-蘇氨酸加入量的I?1.2當量。

根據一個具體方面，所述制備方法的實施過程如下:取L-蘇氨酸，甲酸銨，L-蘇氨酸脫氨酶，全細胞，磷酸吡哆醛，溶解在水中，控制溫15°C?50°C，攪拌反應，利用液相色譜-質譜聯用(LC/MS)監測反應的轉化率，至轉化率超過98%，停止反應。進一步地，所述方法還包括在反應結束后，以等電點結晶和薄膜蒸發分離技術相結合的方法分離產物。更具體地，反應結束后，加熱體系至7(T80°C，破壞酶蛋白，離心除去蛋白，上層清液用甲酸調節pH為5.5飛(最優選5.8)蒸發回收水得淺黃色固體，進一步用甲醇洗滌該淺黃色固體，抽濾，烘干得白色固體即為L-2-氨基丁酸。優選地，所述方法還包括從洗滌淺黃色固體后產生的洗滌液中回收甲酸銨和甲醇。采取等電點結晶與薄膜蒸發分離技術相結合的方法分離產物，同時回收水和甲酸銨，成本低，無廢水，無廢渣，工藝環保。

根據本發明，所述具有亮氨酸脫氫酶和輔酶再生功能的全細胞的來源參考文獻方法(Applied and environmental microbiology 1997, 63 (12): 4651)。L-蘇氨酸、L-蘇氨酸脫氨酶、磷酸吡哆醛及甲酸銨可商購獲得。

本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。

由于以上技術方案的實施，本發明與已有技術相比具有如下優勢:

本發明方法以水代替緩沖鹽溶液構成水相反應體系，原料成本降低；用于催化的L-蘇氨酸脫氨酶和全細胞均可由微生物發酵大規模生產，成本低，來源廣；生物酶促催化反應為水相反應，酶法轉化條件溫和，原料轉化徹底，后處理簡單，采取等電點結晶與薄膜蒸發分離技術相結合的方法分離產物，同時回收水和甲酸銨，成本低，無廢水，無廢渣，工藝環保，適于產業化生產L-2-氨基丁酸。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細的說明，但本發明并不限于以下實施例。

取L-蘇氨酸100mg,甲酸銨160mg,L_蘇氨酸脫氨酶0.6mg,全細胞(Applied andenvironmental microbiology 1997, 63 (12): 4651) 50mg,憐酸批P多醒(PLP) 0.05mg,溶解在ImL水中，保持水浴溫度35°C，攪拌，轉速500rpm。LC/MS跟蹤檢測轉化情況，22h轉化率 98.6%。