> CAS號數(shù)據(jù)庫 > 1492-24-6 > 1492-24-6 / 谷氨酸變位酶與天冬氨酸-β-脫羧酶偶聯(lián)催化L-谷氨酸合成L-2-氨基丁酸
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圖片來源：ACS Catal.
首先對純化的GM進(jìn)行了表征，在37℃時(shí)，催化L-glutamate轉(zhuǎn)化為3-甲基天冬氨酸的比活力為7.5u/mg。同時(shí)，選擇了一種來源于抗輻射不動桿菌的、對L-天冬氨酸具有高β-脫羧活性的Asd（ArAsd）作為促進(jìn)3-甲基天冬氨酸轉(zhuǎn)化為L-ABA的第二種酶。然而，由于底物的特異性，沒有檢測到WT-ArAsd對3-甲基天冬氨酸的活性，這也是氨基酸脫羧酶的一個顯著特征。為了提高3-甲基天冬氨酸β-脫羧活性，在酶結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了對ArAsd分子改造。底物進(jìn)入活性位點(diǎn)的通道有兩個重要的氨基酸殘基S486和K18，將K18變成A18后，在結(jié)構(gòu)上通道口變大。
圖片來源：ACSCatal.
為了進(jìn)一步提高ArAsd對3-甲基天冬氨酸的活性，考慮對催化口袋進(jìn)行進(jìn)化。Asd屬于I型PLP酶家族，將L-天冬氨酸轉(zhuǎn)化為L-丙氨酸和CO2，PLP共價(jià)結(jié)合在催化口袋的Lys315上，ArAsd中對應(yīng)的殘基為Lys314。因此，首先考慮PLP 5A范圍內(nèi)的殘基。為了確定調(diào)控底物特異性的關(guān)鍵殘基，對這些殘基進(jìn)行了丙氨酸掃描誘變，結(jié)果是雙突變K18A/V287I的酶活最高。
圖片來源：ACSCatal.
最終，以谷氨酸為唯一底物，通過GM與Asd的偶聯(lián)反應(yīng)，構(gòu)建了合成L-2-氨基丁酸的級聯(lián)反應(yīng)。根據(jù)GM和K18A/V287I的特性，反應(yīng)在pH 6.6和37℃下進(jìn)行，培養(yǎng)4h后，L-谷氨酸（4.5mm）轉(zhuǎn)化率為90%，檢測到L-ABA的含量為4.45mM，L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為L-ABA的轉(zhuǎn)化率高達(dá)98.9%。
圖片來源：ACSCatal.
參考文獻(xiàn)：Enzymatic Biosynthesis of L?2-Aminobutyric Acid by Glutamate Mutase Coupled with L?Aspartate-β-decarboxylase Using L?Glutamate as the Sole Substrate
ACS Catal.
DOI：10.1021/acscatal.0c04141