302-79-4/全反式維甲酸對抗腎小球基底膜腎炎小鼠模型腎臟損害的保護作用

新月體腎炎是各型腎炎中預后最差的一種類型，臨床進展十分迅速，若不及時進行診斷和治療，多數患者將于數周至數月內進展至終末期腎衰竭或死亡。其病理主要表現為大量新月體形成，腎小球或腎間質內大量以單核、淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤［1］。全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid, ATRA)是維甲酸的衍生物，對調節細胞增殖、分化、凋亡、免疫及炎癥反應起重要作用［2-3］，但維甲酸對新月體腎炎的作用和機制尚不十分清楚。腎毒性血清腎炎模型（nephrotoxicserum nephritis，NTSN），又稱為抗腎小球基底膜腎炎模型，表現為新月體形成、大量炎癥細胞浸潤、腎小球基底膜破壞，是新月體腎炎研究最常用的模型［4］。因此我們在本研究中擬探討全反式維甲酸對NTSN的作用和機制。

材料與方法

一、主要實驗材料

野生型C57BL/6J小鼠購自杰克遜實驗室。腎毒性血清（nephrotoxic serum， NTS）凍干粉劑由美國波士頓醫學院David J. Salant教授惠贈。羊免疫球蛋白（杰克遜免疫研究實驗室013-000-003）、完全弗氏佐劑（Sigma-F5881）、全反式維甲酸（sigma公司）、尿白蛋白ELISA檢測試劑盒（Bethyl Laboratory）、尿肌酐檢測試劑盒（DICT-500,Bioassay Systems）、血清尿素氮檢測試劑盒（BioAssay Systems）、CD8淋巴細胞單克隆抗體（Biolegend 100703）、CD4淋巴細胞單克隆抗體（Abcam ab25475）、CD68單核/巨噬細胞單克隆抗體（Abcamab5344）、Alexa Fluor 568標記的山羊抗大鼠IgG（Thermo Fisher Scientific）、Trizol (Thermo Fisher Scientific)、CDNA合成試劑盒（Thermo Fisher Scientific）、SYBR PCR試劑盒（Applied Biosystems)。

二、模型建立［5］

15只野生型C57BL/6J小鼠，隨機均分為對照組、NTS組、NTS+維甲酸處理組。使用無菌PBS溶解NTS凍干粉末至終濃度為67mg/ml。0.5 mg羊IgG和45 μl完全弗氏佐劑腹腔注射預處理。全反式維甲酸溶于花生油和5%二甲亞砜，預處理后24 h給予全反式維甲酸16 mg/kg腹腔注射，對照組腹腔注射溶媒，每天注射一次，直至處死小鼠。預處理5 d后予100 μl NTS尾靜脈注射構建腎毒性血清腎炎模型，對照組注射100 μl PBS。NTS注射7 d后處死小鼠。

三、組織標本的收集

小鼠麻醉后仰面固定于操作臺，暴露腹腔，下腔靜脈取血、膀胱取尿后，從心臟進針建立靜脈通道，使用PBS灌注5 min后取下雙側腎臟，將腎臟對切，一半腎組織樣本用于提取RNA-80℃保存。一半腎組織福爾馬林固定，石蠟包埋后行組織切片（4 μm）；一半腎組織OCT包埋后行冰凍切片（4μm）。

四、蛋白尿和血清尿素氮檢測

根據尿白蛋白檢測試劑盒說明和尿肌酐檢測試劑盒說明分別檢測小鼠尿白蛋白、尿肌酐，取兩者的比值，得到尿微量白蛋白/肌酐（urinary microalbumin/ creatinine ratio,UACR）。根據商品化試劑盒說明檢測小鼠血清尿素氮濃度。

五、腎臟組織病理學分析［6］

石蠟組織切片行HE染色，對腎臟的損害程度采用百分比評分法進行評估，即觀察整個腎切片所有的腎小球，計算合并有新月體的腎小球數量、節段硬化的腎小球數量，除以腎小球數量的總和，得到百分比。

六、免疫熒光染色［6］

腎臟組織冰凍切片在預冷的丙酮溶液中固定15 min，PBS洗3遍，封閉液（含2%BSA、10%的山羊血清）室溫孵育1h，然后分別使用CD8淋巴細胞單克隆抗體、CD4淋巴細胞單克隆抗體或CD68單克隆抗體孵育過夜，第2天PBS清洗3遍，使用相應的熒光二抗孵育1 h，PBS清洗3遍后使用帶DAPI的封片液封片。熒光顯微鏡于相同的曝光時間獲取照片，每只實驗小鼠獲取15個視野的圖片，使用Image J設定相同的閾值，分別定量CD8+、CD4+陽性細胞總數，CD68陽性細胞的面積。

七、實時熒光定量PCR分析基因表達

Trizol法提取腎皮質總RNA，測量RNA的濃度，每只小鼠轉錄1 μg總RNA，逆轉錄試劑盒合成cDNA，使用SYBR試劑盒和下列引物分析基因的表達，GAPDH作為內參。LTN-F: 5′-GCGAATTCAGCAAGACCTCAGCCATGAG-3′; LTN-R5′-CCAAGCTTGAGGCTGTTACCCAGTCAGGGT-3′; Ccl2-F：5′-TTAAAAACCTGGATCGGAACCAA-3′；Ccl2-R：5′-GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT-3′；ICAM1-F：5′-GTGATGCTCAGGTATCCATCCA-3′；ICAM1-R：5′-CACAGTTCTCAAAGCACAGCG-3′；GAPDH-F：5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′；GAPDH-R：5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。

八、統計學分析

計量資料采用±sD，均數比較采用方差分析（ANOVA，Bonferroni校正），GraphPad Prism 7軟件用于統計分析。P<0.05被認為具有統計學意義。

結果

一、維甲酸可改善NTSN模型小鼠蛋白尿和腎功能

ELISA方法檢測小鼠UACR：對照組、NTS組、NTS+維甲酸組UACR的平均值分別為：（0.23±0.07)×10-3 mg/g, (4.52±0.36)×10-3 mg/g、 （2.63±0.18）×10-3mg/g；；NTS組和NTS+維甲酸組比較差異有統計學意義（q=18.45，P<0.01），見圖1。

血清尿素氮檢測結果示：對照組、NTS組、NTS+維甲酸組BUN均值分別為：(8.90±1.68) mmol/L,（16.81±1.23） mmol/L,（13.33±0.62) mmol/L; NTS組和NTS+維甲酸組比較差異有統計學意義（q=6.155，P<0.01），見圖1。

二、維甲酸可改善NTSN模型小鼠腎組織病理改變

觀察腎組織切片所有的腎小球，計數合并有新月體的腎小球數量、節段或球型硬化的腎小球數量，分別除以腎小球總數量，即得到百分比。每組小鼠（n=5）再取平均值進行統計分析。對照組未發現新月體、節段或球性硬化；NTS組合并有新月體的腎小球百分比為：（36±1.58）%；NTS+維甲酸組合并有新月體的腎小球百分比為：（22.2± 1.92）%；兩組間差異有統計學意義（q=21.46，P<0.01）。NTS組、NTS+維甲酸組的腎小球硬化率分別為：（18.4±1.14）%、（13.0±1.58）%， 差異有統計學意義（q=10.73，P<0.01），見圖2。

三、維甲酸可減輕NTSN模型小鼠CD8+淋巴細胞的浸潤

對腎臟冰凍組織切片行CD8+T細胞免疫熒光染色，在200倍的顯微鏡下獲取圖片，每只小鼠獲取15個視野的圖片，使用ImageJ計量CD8+T細胞總數，得到CD8+T細胞均數/每低倍鏡視野，每組小鼠（n=5）再取平均值進行統計分析。每低倍鏡視野下CD8+T細胞均數：對照組為3.44±0.82個；NTS組為25.72±1.56個；NTS+RA組為17.45±2.85個；NTS組與NTS+維甲酸組差異有統計學意義（q=9.545，P<0.01）見圖3。

四、維甲酸可減輕NTSN模型小鼠CD4+淋巴細胞浸潤

對腎臟冰凍組織切片行CD4+T細胞免疫熒光染色，在200倍的顯微鏡下獲取圖片，每只小鼠獲取15個視野的圖片，使用ImageJ計量CD8+T細胞總數，得到CD8+T細胞均數/每低倍鏡視野，每組小鼠（n=5）再取平均值進行統計分析。每低倍鏡視野下CD4+T細胞均數：對照組為(1.23±0.45)個；NTS組為(16.25±1.58)個；NTS+維甲酸組為(9.65±2.20)個；NTS組與NTS+維甲酸組差異有統計學意義（q=8.610，P<0.01），見圖4。

五、維甲酸可減輕NTSN小鼠模型單核和（或）巨噬細胞浸潤

對腎臟冰凍組織切片行CD68免疫熒光染色，在400倍的顯微鏡下獲取圖片，每只小鼠獲取15個視野的圖片，使用ImageJ計量CD68陽性細胞面積，得到CD68陽性細胞面積均數/每高倍鏡視野，每組小鼠（n=5）再取平均值進行統計分析。每高倍鏡視野下CD68細胞面積均數：對照組為(0.03±0.01)pixel2；NTS組為(0.74±0.06) pixel2；NTS+維甲酸組為：(0.42±0.09)pixel2；NTS組與NTS+維甲酸組差異有統計學意義（q=11.08，P<0.01），見圖5。

六、維甲酸可抑制NTSN模型小鼠炎癥細胞趨化因子的表達

腎皮質相關炎癥細胞趨化因子基因表達的定量分析結果提示：NTS組人單核細胞趨化蛋白-1（monocytechemoattractant protein-1，MCP-1) 的表達量較對照組增加約11.3倍，NTS+維甲酸組MCP-1的表達量較對照組增加約6.6倍，NTS組和NTS+維甲酸組差異有統計學意義（q=5.109，P<0.01）。NTS組細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的表達量較對照組增加約4.95倍，NTS+維甲酸組ICAM-1的表達量較對照組增加約1.65倍，NTS組和NTS+維甲酸組差異有統計學意義（q=3.581，P<0.05）。NTS組淋巴細胞趨化因子（lymphotactin，LTN)的表達量較對照組增加約27.89倍，NTS+維甲酸組LTN的表達量較對照組增加約17.47倍，NTS組與NTS+維甲酸組差異有統計學意義（q=11.29，P<0.01），見圖6。

討論

ATRA是維甲酸的一代衍生物，是維甲酸體內發揮生物學效應的主要成分，對調節細胞聚集、分化、凋亡、增殖及炎癥反應起重要作用。維甲酸在細胞核內的兩組受體，即維甲酸受體(retinoic acid receptors，RARs)和維甲酸 X受體(retinoid X receptors，RXRs)普遍存在于各種細胞中，是配體依賴的轉錄調節子。ATRA主要通過與 RAR高親和力特異性地結合而發揮生物學效應。當缺乏 ATRA時，RAR／RXR形成異質二聚體，與ATRA調控的靶基因啟動區域維甲酸反應元件 (retinoic acid response element，RARE)結合，同時募集阻遏蛋白和組蛋白脫乙?；?(histonedeacetylases，HDAC)至相應DNA區域，HDAC重組蛋白轉移乙?；?，改變染色質結構從而對基因轉錄起到抑制作用。當 ATRA存在時，ATRA與 RAR高親和力結合，RAR發生構型改變，釋放阻遏蛋白，同時募集共激活蛋白如組蛋白乙酰轉移酶，激活ATRA調控的靶基因轉錄及表達，從而發揮對細胞的生物活性調控作用［7］。

維甲酸缺乏或者RAR/RXR敲除可導致小鼠腎臟單位的減少［8］。在抗Thy-1腎炎動物模型中，維甲酸可以通過抑制系膜細胞增殖、減少細胞外基質的沉積、減少單核細胞的浸潤從而限制腎臟損害［9］。在嘌呤霉素氨基核苷腎病大鼠模型中，維甲酸處理組有較少的間質單核細胞浸潤，纖維連接蛋白表達減少，對單核細胞浸潤起關鍵作用的MCP-1的表達量也減少［10］。在糖尿病腎病的早期模型中，維甲酸可以通過降低腎臟MCP-1和ED-1的蛋白合成，降低蛋白尿水平。體外用維甲酸處理培養的足細胞，可以通過減少單核趨化蛋白的合成從而減少炎癥通路的激活［11］。在狼瘡性腎炎的小鼠模型中，維甲酸可以減少腎臟趨化因子和細胞因子的表達、減少腎小球IgG沉積、減少蛋白尿、改善腎小球病變［12］。然而維甲酸在新月體腎炎中的作用和機制卻不十分清楚。

NTSN模型是以CD8+T細胞浸潤為主的新月體腎小球腎炎［13］，巨噬細胞招募在病程中起關鍵作用，TH1細胞激活亦發揮著重要的作用。我們的研究發現維甲酸可以減輕蛋白尿、改善腎功能、減少新月體的形成，與以往的報道一致［5］。NTSN模型小鼠較對照小鼠CD8+T細胞和巨噬細胞浸潤明顯增加，符合疾病的自然病程；同時本研究模型維甲酸可以明顯減少淋巴細胞和巨噬細胞的浸潤，既往未見維甲酸減少淋巴細胞浸潤的報道。

維甲酸可以明顯減少CD8+T細胞和巨噬細胞的浸潤，表現為腎小球和腎間質的CD8+T細胞和巨噬細胞浸潤明顯減少。ICAM-1和MCP-1在巨噬細胞招募中起至關重要的作用［14-15］，而我們的研究表明維甲酸可以明顯抑制ICAM-1和MCP-1在腎皮質的基因表達水平，ICAM-1和MCP-1的表達減少可能導致了巨噬細胞浸潤減少。CD8+T細胞、NK細胞、肥大細胞均能產生 LTN，而CD4+T細胞或單核細胞不表達LTN［13］。LTN特異性的趨化CD8+T 細胞和自然殺傷細胞，本研究發現在NTSN的模型中LTN表達量顯著增高，而全反式維甲酸處理可以減少腎臟皮質LTN的表達，浸潤的CD8+T細胞減少可能與LTN因子表達減少有關。

激活的TH1細胞可以招募更多的炎癥細胞，刺激巨噬細胞產生腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、一氧化氮（NO）等損傷調節因子，導致腎小球壁層上皮細胞增殖，促進特征性的新月體形成［4］。本研究的結果提示維甲酸處理可以明顯減少腎間質的CD4+淋巴細胞的數量，減少新月體形成，可能與維甲酸抑制一系列炎癥因子的表達有關。如Oseto等［16］曾報道在抗腎小球基底膜腎炎模型中，ATRA可以減少腎小球增殖細胞核抗原（proliferating cellnuclear antigen，PCNA）陽性細胞、ED-1陽性細胞數和α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA) 陽性面積，抑制TNF-α、白介素-1β（IL-1β）、增強子結合蛋白-δ（CCAAT/enhancer binding protein-δ，C/EBPδ)、血小板衍生生長因子(platelet-derivedgrowth factor,PDGF)、轉化生長因子-β（TGF-β）、Ⅰ型膠原和α-SMA等基因表達，從而減輕蛋白尿、減少腎臟新月體形成。Rao等［17］發現ATRA處理可以通過增加IkBa活性、抑制核因子-kB（NF-kB） p65活性，從而下調TNF-a 和IL-6的表達，保護肝臟的缺血再灌注損傷。Nozaki等［18］發現ATRA可以減少IL-6、IL-12、TNF-a等細胞因子的表達，減少巨噬細胞的浸潤，從而減輕膠原誘導的關節炎小鼠模型的關節損害。在LPS的模型中，維甲酸可以抑制LPS誘導的巨噬細胞產生IL-12，維甲酸誘導的IL-12抑制依賴于NF-kB活性的抑制［19］。這些均說明NF-kB活性的抑制是維甲酸抗炎的可能機制，維甲酸可能通過抑制NF-kB通路，廣泛抑制炎癥細胞因子的表達。

新月體形成預示著疾病預后差，而炎癥細胞浸潤在新月體的發展發展中起至關重要作用，我們的研究顯示，維甲酸可以減少炎癥趨化因子的表達，從而減少炎癥細胞的浸潤，改善腎功能和腎臟組織學，是臨床上治療新月體腎炎有應用潛力的一個藥物。

參考文獻（略）

李正東, 方凡, 徐波, 等. 全反式維甲酸對抗腎小球基底膜腎炎小鼠模型腎臟損害的保護作用［J/CD］.中華腎病研究電子雜志,2019，8(3)：114-120.