34980-39-7 / 昆布二糖的制備方法

背景及概述^[1]

昆布二糖是β－1，3糖苷鍵連接的還原性二糖，是一種功能多樣的高價值寡糖。它可以作為合成透明質酸的前體物質應用于制藥及化妝品行業，作為促發芽劑和天然防腐劑應用于農業領域，且其具有益生作用，可以作為食品添加劑應用于食品保健品行業，另外，還可以調控嗜熱菌熱纖維梭菌的蛋白表達。昆布二糖的傳統制備方法是以稀酸水解天然產物，但天然產物供應有限，導致昆布二糖價格居高不下。因此，開發成本低廉、環境友好的昆布二糖高效合成技術，對高附加值功能性寡糖生物制備具有重要意義。目前，昆布二糖的生產主要還是傳統的稀酸水解松針或者昆布等多糖。該工藝過程產率低、分離提取成本高，導致昆布二糖的價格居高不下。昆布二糖還能利用化學合成進行制備，利用鹵素糖基作為糖基供體，通過來源于Koenigs-Knorr方法的O糖基化獲得昆布二糖。然而最終產品不容易純化，最終得率低于10％。隨著工業酶生物技術的發展，有科學家開始嘗試酶法合成昆布二糖。日本科學家就利用3個酶(蔗糖磷酸化酶，葡萄糖異構酶和昆布二糖磷酸化酶)，以蔗糖為底物生產昆布二糖，然而昆布二糖的得率只有50％左右，導致后續產品分離的成本較高。因此，亟待開發一種低成本，低污染，高得率的昆布二糖酶制備方法。

制備^[2]

通過體外多酶催化體系將淀粉和葡萄糖轉化為昆布二糖的催化途徑見圖。

其中涉及的關鍵酶包括：(1)淀粉磷酸化酶(αGP，EC2.4.1.1)，用于從淀粉上釋放出葡萄糖-1-磷酸；(2)昆布二糖磷酸化酶(LBP，EC2.4.1.31)，用于催化葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖生成昆布二糖。高效液相色譜檢測昆布二糖的濃度。取反應樣品94.5μL，加入5.5μL10％的硫酸終止反應。離心取上清，采用HPLC檢測昆布二糖出峰面積和峰高計算昆布二糖的濃度。因昆布二糖磷酸化酶有可能催化葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸生成纖維二糖，所以首先對所使用的昆布二糖磷酸化酶專一性進行鑒定。，昆布二糖保留時間為7.7-7.8分鐘，與葡萄糖、磷酸出峰時間都不重疊，但與纖維二糖出峰時間相近，為了確定產物只有昆布二糖，而無纖維二糖，采用薄層層析色譜進行定性檢測，標品纖維二糖和昆布二糖斑點位置并不重疊，可以進行定性檢測，而反應液樣品中出現與葡萄糖標品對應的斑點，與葡萄糖-1-磷酸標品對應的斑點，以及與昆布二糖標品對應的斑點，但是并未出現與纖維二糖標品對應斑點，由此可知，葡萄糖與葡萄糖-1-磷酸經該昆布二糖磷酸化酶催化并無纖維二糖生成，因此，可以用高效液相色譜進行昆布二糖定量。昆布二糖濃度與HPLC肌醇特征峰的響應強度成正比。昆布二糖響應強度逐漸增加，葡萄糖響應強度逐漸下降。經標準曲線斜率計算，昆布二糖的終濃度(圖4A)是23mM，相對淀粉(10g/L，約61.3mM葡萄糖當量)轉化率為37.5％。

主要參考資料

[1] 天津工業生物所在體外合成昆布二糖方面取得新進展

[2] CN201711014505.3一種制備昆布二糖的方法