根據2017年美國肝病研究協會(AASLD)和加拿大肝病研究協會(CASL)的2015年共識指南，利巴韋林通常用作多種一線和二線聯合用藥的輔助治療推薦每種基因型的療法。加入利巴韋林可通過在治療過程中盡早加速病毒清除來降低復發率。

作為丙型肝炎病毒感染治療方法開發的新藥可用于減少或消除利巴韋林的使用，而這與嚴重的不良反應有關。它們還可提高失敗的Peginterferon alfa-2a / Peginterferon alfa-2b和利巴韋林治療的患者的治療效果。目前正在研究利巴韋林在治療急性髓細胞性白血病中的潛在用途。

當用于治療丙型肝炎病毒(HCV)感染時，它總是被用作聯合療法的一部分，因為利巴韋林單藥治療在慢性丙型肝炎感染中無效，另外，在方案中利巴韋林可能會增加貧血的風險。

利巴韋林通過增加幾種RNA病毒基因組中的突變頻率來介導針對多種DNA和RNA病毒的直接抗病毒活性，它是干擾病毒遺傳物質復制的核苷類抗代謝藥物的成員。由于該藥物與RNA分子的結構基團相似，因此抑制了RNA依賴的RNA聚合酶的活性。

據報道，利巴韋林具有幾種作用機理，導致抑制病毒RNA和蛋白質合成。腺苷激酶激活后，可以合成利巴韋林的單，二和三磷酸代謝產物。利巴韋林三磷酸(RTP)是主要的代謝產物，可通過與酶的核苷酸結合位點結合而直接抑制病毒mRNA聚合酶，這會阻止正確核苷酸的結合，從而導致病毒復制減少或產生有缺陷的病毒粒子。RTP還顯示出對登革病毒的病毒mRNA鳥苷轉移酶和mRNA 2'-O-甲基轉移酶的抑制作用。對這些酶的抑制通過在5'端摻入利巴韋林代替鳥苷來破壞病毒mRNA 5'端的翻譯后加帽，并阻止了帽的甲基化步驟。

抑制宿主肌苷單磷酸脫氫酶(IMPDH)和隨后耗盡GTP庫被認為是利巴韋林的另一種作用機理。IMPDH催化限速步驟，其中在鳥苷單磷酸酯(GMP)合成過程中將肌苷5'-單磷酸酯轉化為黃嘌呤單磷酸酯。GMP隨后轉換為鳥嘌呤三磷酸(GTP)。利巴韋林單磷酸酯模擬肌苷5'-單磷酸酯，并且是IMPDH的競爭性抑制劑。鳥嘌呤核苷酸的從頭合成的抑制和細胞內GTP池的減少導致病毒蛋白質合成的下降，并限制了病毒基因組的復制。

利巴韋林在靶病毒中充當誘變劑，由于病毒突變增加而引起“錯誤災難”。RTP與胞苷三磷酸酯或尿苷三磷酸酯同等效率配對，并阻斷HCV RNA延長。它會導致新生HCV RNA的過早終止，并通過產生有缺陷的病毒體來增加誘變作用。

利巴韋林還通過轉移Th2反應而有利于Th1表型，從而對病毒發揮宿主的免疫調節作用。Th2反應和2型細胞因子(例如IL-4，IL-5和IL-10)的產生刺激了體液反應，從而增強了對病毒的免疫力。利巴韋林增強了干擾素相關基因(包括干擾素-α受體)的誘導，并下調了干擾素抑制，細胞凋亡和肝星狀細胞活化相關基因。