3681-93-4/牡荊素的提取方法及代謝分析

背景及概述^[1][2]

牡荊素學(xué)名為5,7,4’-三羥基黃酮-8-C-β-D-葡萄糖苷，是從干燥山楂葉中分離提取得到的一種活性單體，是最具代表性的黃酮碳苷天然產(chǎn)物之一。牡荊素具有活血化瘀、防癌抗癌、抗氧化、抗炎、促進(jìn)成骨分化等廣泛的藥理作用。相關(guān)研究結(jié)果顯示該化合物具有增加冠脈和心肌血流量、降低血管阻力、降低血漿黏度、抑制血栓形成、保護(hù)心臟免受心肌缺血和再灌注損傷等作用，臨床上牡荊素廣泛用于治療心血管疾病。

提取方法^[1]

現(xiàn)在，許多植物提取廠家都在生產(chǎn)牡荊素類植物提取物，除了牡荊提取物以外，還有山楂提取物等。他們都是以牡荊素為指標(biāo)在生產(chǎn)，產(chǎn)品也是以牡荊素為指標(biāo)向客戶銷售。但是這類提取物所含的牡荊素含量都很低，如山楂提取物中牡荊素的含量只有0.7％左右。從天然植物中提取分離牡荊素、異牡荊素一般采用硅膠柱色譜、SephadexLH-20柱色譜和制備HPLC聯(lián)用的方法，工藝都比較復(fù)雜。

本發(fā)明的發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有的天然產(chǎn)物提取物中，牡荊素和異牡荊素含量不高等缺點(diǎn)，提供一種從天然產(chǎn)物中提取分離并同時(shí)獲得含量大、高純度的牡荊素和異牡荊素的方法。一種從天然產(chǎn)物中提取分離異牡荊素和牡荊素的方法，所述天然產(chǎn)物為檀香葉。所述提取分離方法，可以參照現(xiàn)有的從其它天然產(chǎn)物中提取分離牡荊素和異牡荊素的方法進(jìn)行。

作為一種優(yōu)選方案，所述方法優(yōu)選為以醇類溶劑對(duì)檀香葉進(jìn)行提取得到醇提物，用酯類溶劑對(duì)醇提物進(jìn)行萃取，所得酯類溶劑萃取物經(jīng)過(guò)柱層析和制備液相分離分別得到異牡荊素和牡荊素。所述醇類溶劑為常用的低分子量醇類溶劑，作為一種優(yōu)選方案，所述醇類溶劑優(yōu)選為乙醇。所述酯類溶劑為常用的低分子量酯類溶劑，作為一種優(yōu)選方案，所述酯類溶劑優(yōu)選為乙酸乙酯。作為一種更優(yōu)選方案，所述從天然產(chǎn)物中提取分離牡荊素和異牡荊素的方法，包括如下步驟：（1）用乙醇對(duì)檀香葉進(jìn)行超聲和/或浸提，得到檀香葉乙醇粗提物；

（2）依次采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯對(duì)檀香葉乙醇粗提物進(jìn)行液液萃取；收集乙酸乙酯萃取液，濃縮，干燥，得到乙酸乙酯萃取物；

（3）將步驟（2）得到的乙酸乙酯萃取物在層析柱中進(jìn)行分離；所述分離選用乙酸乙酯、甲醇組成的洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集合并洗脫液，對(duì)洗脫液進(jìn)行重結(jié)晶，得到異牡荊素；

（4）步驟（3）重結(jié)晶后的余液進(jìn)行制備液相分離純化，得到牡荊素。

代謝^[2]

1 牡荊素質(zhì)譜裂解分析

牡荊素碎片離子圖見圖 3。牡荊素(C21H20O10)保留時(shí)間為 6.84 min，正離子模式給出準(zhǔn)分子離子峰 m/z 為433.1118 [M+H]+；在 Q-TOF-MS/MS中，牡荊素的飛行時(shí)間質(zhì)譜主要有3 條裂解途徑：

①母離子葡萄糖基的環(huán)破裂，失去小分子 C4H8O4，伴隨氫原子的1，3 移變形成醛的奇電子離子a(M-120，m/z 313.07)，該離子不穩(wěn)定，失去醛基自由基正離子，即黃酮芐基離子b(M-150，m/z283.06)；

②母離子的葡萄糖基的環(huán)破裂和重排，分別形成離子c(M-96，m/z 337.07) 和離子d(m/z 323.09)；

③母離子連續(xù)失水，分別形成離子 e(m/z 415.10) ， 離子f(m/z397.09) 和 離子g(m/z379.08)，離子 g 繼續(xù)破環(huán)失去小分子 C4H4O2 形成離子 h(m/z 295.06)，失去 CH2CO 形成離子 c；牡荊素的具體裂解途徑見圖4。

2 牡荊素代謝產(chǎn)物分析

使用 Metabolynx XS 篩選得到代謝產(chǎn)物共 3個(gè)，包括一相代謝產(chǎn)物 1 個(gè)，二相代謝產(chǎn)物2 個(gè)。主要代謝反應(yīng)包括氧化，甲基化和 D-葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)等。詳細(xì)見表 1~2。

M1(C22H22O11)，保留時(shí)間為 7.51 min，準(zhǔn)分子離子峰為 m/z 463.122 4[M+H]+，比母藥 多30 Da；在 Q-TOF-MS/MS 中，母離子糖環(huán)失去 1分子 H2O 獲得碎片 m/z 445.13，再失去1 分子H2O獲得碎片 m/z 427.10，進(jìn)一步失去甲氧基得到碎片m/z 397.09；糖環(huán)破裂失去分子 C4H8O4，獲得碎片m/z 343.08(M-120)，進(jìn)一步失去醛基自由基或甲氧基獲得碎片 m/z 313.07，通過(guò)失去醛基獲得的碎片m/z 313.07 失去甲氧基可獲得碎片 m/z 283.06；母離子糖環(huán)破裂進(jìn)行重排，失去分子 CH2CO，形成碎片m/z 421.24，若失去 CH2，獲得碎片 m/z 397.09；母離子糖環(huán)失去分子 C2H8O4，形成碎片 m/z 367.08(M-96)，失去甲氧基獲得碎片 m/z 337.08，所以可以推測(cè)代謝物 M1 為甲氧基牡荊素， 可能發(fā)生甲氧基取代位點(diǎn)分別為 6，2’，3’，5’和 6’，具體位點(diǎn)需要通過(guò)核磁共振分析手段進(jìn)一步確證。其質(zhì)譜圖見圖5A。 M2 和 M3(C27H28O16)，準(zhǔn)分子離子峰分別為 m/z 609.146 4[M+H]+和 m/z 609.147 4[M+H]+，保留時(shí)間分別為 4.66 min 和 5.95 min， 準(zhǔn)分子離子比母藥分子離子峰多 C6H8O6(176 Da)，應(yīng)該是葡萄糖醛酸，如圖 5B 和圖5C 所示，在 M1和M2的Q-TOF-MS/MS 中，可見特征碎片離子 m/z433.11(M-176)為牡荊素準(zhǔn)分子離子，而且m/z415.10，397.09，337.07，313.07，283.06 為牡荊素的特征碎片離子，所以推測(cè)該 2 個(gè)代謝物是牡荊素的葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物，并且推測(cè)它們?yōu)橥之悩?gòu)體，從牡荊素的結(jié)構(gòu)式可以看出，比較容易發(fā)生葡萄糖醛酸化結(jié)合位點(diǎn)分別為5，7， 4’的羥基，具體位點(diǎn)需要通過(guò)核磁共振分析手段進(jìn)一步確證。

主要參考資料

[1] CN201110128215.8 一種從天然產(chǎn)物中提取分離牡荊素和異牡荊素的方法

[2]徐聰,樓燕,盧祺炯,王佳虹,辛艷飛,鄭高利.牡荊素在大鼠體內(nèi)的代謝研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2018,35(09):1365-1369.