38894-11-0 / 酚試劑的應用

背景及概述^[1]

酚試劑是一種常用的測定蛋白質試劑，與蛋白質的呈色反應包括二步：第一步是在堿性條件下，蛋白質與銅作用生成蛋白質-銅復合物;第二步是蛋白質-銅復合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑，生成藍色物質。在一定條件下，藍色強度與蛋白質的量成正比。此法是生化工作領域內較廣泛應用的一種蛋白質濃度測定的方法。優點是操作簡便，靈敏度高，可測25～250μg蛋白質;缺點是該試劑只與蛋白質中酪氨酸、色氨酸起反應，因此有蛋白質特異性影響，即不同蛋白質因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度稍有不同，標準曲線也不是嚴格直線。

應用^[2-3]

應用一：

現有的對空氣中甲醛含量的測定方法，多利用一些列酶與甲醛發生的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長處吸光度上升的程度，從而測算出甲醛的濃度大小。這些方法中所選酶系復雜，具有一定的檢測成本，且計算過程相對保密，限制了使用范圍。并且其精確度較低，屬于定性測量，限制測定的場所。針對現有技術中的不足，利用酚試劑比色法來測定空氣中甲醛含量，靈敏度高，選擇性好，操作簡便。

技術方案為：一種空氣中甲醛含量測定方法，利用不同濃度的甲醛與酚試劑反應生成嗪，采用酚試劑比色法繪制標準曲線，然后在硫酸鐵銨的高鐵離子存在下，嗪在酸性溶液中被高鐵離子氧化形成藍綠色化合物，根據顏色深淺，比色測定得出空氣中甲醛含量，具體包括以下步驟：

(1)采樣：采樣前，被采樣房間必須密閉24小時，采樣需在風平浪靜氣候環境下進行，用一個內裝5毫升吸收液的大型氣泡吸收管，以0.5升/分流量，采氣10升；

(2)標準曲線的繪制：取8支10毫升的比色管，按照下表配制標準色列：

在各管中加入0.40毫升1％硫酸鐵銨溶液，搖勻，放置15分鐘后，用1厘米的比色皿，于波長630納米處，以水為參比，測定吸光度，以吸光度對甲醛含量(微克)，繪制標準曲 線，或用最小二乘法計算標準曲線的回歸方程式：

Y＝bX+a——(a)

(a)式中：

Y—(A-A0)，即標準溶液吸光度(A)與試劑空白液吸光度(A0)之差；

X—甲醛含量，微克；

b—回歸方程式的斜率；

a—回歸方程式的截距，

(3)樣品測定：采樣后，將樣品溶液移入比色管中，用少量吸收液洗滌吸收管，洗液 并入比色管使總體積為5毫升；

(4)、數據處理，按照下式計算甲醛溶液的濃度C，單位：毫克/毫升，

(b)式中：

A—樣品溶液吸光度；

A0—試劑空白液吸光度；

b—回歸方程式的斜率；

a—回歸方程式的截距；

Vr—換算為參比狀態下的采樣體積，單位為升。

應用二：

目前，檢測蛋白質常用的方法有凱氏定氮法、自動定氮儀法、雙縮脈法，通過同時 對飼料中的粗蛋白質進行測定，并對結果進行了分析比較，結果表明：凱氏定氮法測定所用的時間較長，測得結果比較穩定；自動定氮儀同國標法相比，結果偏高，相對偏差較小，但實 驗成本高；雙縮脈法測定結果偏低，偏差較大，但操作簡單，效率高，更適合飼料廠等企業的快速測定。因此，這些缺點使得以上方法均無法滿足企業實際生產的需要。酚試劑可用于提供一種牧草飼料中蛋白質的檢測方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

檢測步驟如下：

（1）稱取牧草飼料粉碎，放入燒瓶中，加入氫氧化鈉溶液，放入60℃的水浴中5h進行反 應，取出搖勻，加入蒸餾水稀釋40倍，離心5min，靜置；

（2）取上清液放入試管中，加入酚試劑甲液，混合均勻，于38℃恒溫水浴中放置20min；再加入酚試劑乙液，立即振蕩混合均勻，在38℃恒溫水浴中保溫30min，用1cm光徑比色皿在750nm波長下測定吸光度，并根據測定結果與標準曲線對比得到樣品蛋白質含量。

標準曲線的建立如下：

（1）試劑配制

標準蛋白溶液0.10mg/mL；

酚試劑甲液：將3％碳酸鈉溶液、0.2mol/L氫氧化鈉溶液、0.01％五水硫酸銅溶液、0.02％檸檬酸鉀溶液等體積混合，該溶液當天配制當天使用；

酚試劑乙液：配制濃度為2.5％的鉬酸鈉溶液，與體積分數為85％的濃磷酸進行反應，加入硫酸鋰和溴化氫，稀釋5倍，過濾后，保存在棕色瓶中；使用時前進行標定；

（2）曲線制作

取8支試管，加入不同量的標準蛋白和蒸餾水混勻后，每管加入4mL酚試劑甲液，混勻，于38℃下放置20min；再加入0.4mL酚試劑乙液，立即振蕩混勻，在38℃下保溫30min，用1cm光徑比色皿在750nm下測定吸光度；以蛋白質濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

主要參考資料

[1]常用中藥詞語詞典

[2]CN201710579528.2

[3] CN201610949713.1