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木犀草素（lut）是一類(lèi)典型C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的黃酮類(lèi)化合物，廣泛存在于抗炎植物原料中。木犀草素通常以黃酮苷形式存在，如黃酮氧苷結(jié)構(gòu)的木犀草苷（cyn），以及黃酮碳苷結(jié)構(gòu)的葒草素（ori）與異葒草素（homo）。木犀草素及其黃酮苷具有廣泛生理活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抑制肥胖、緩解II型糖尿病等。而抗炎、抗氧化活性是黃酮類(lèi)化合物發(fā)揮抗腫瘤、抑制肥胖、II型糖尿病等生理活性的基礎(chǔ)。黃酮類(lèi)化合物發(fā)揮抗炎活性的主要場(chǎng)所在免疫細(xì)胞（其中主要是巨噬細(xì)胞），黃酮類(lèi)化合物對(duì)巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)的抑制活性可通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。黃酮類(lèi)化合物在不同水平抑制NF-κB信號(hào)通路下調(diào)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。
結(jié)果顯示，在作用濃度下，與CK組對(duì)比，5 μmol/L的黃酮類(lèi)化合物對(duì)THP-1單核巨噬細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性作用（P＞0.05）。Bay-11-7082是NF-κB抑制劑，其推薦使用濃度為10 μmol/L左右，因此，實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)10 μmol/L的Bay抑制劑細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，10 μmol/L的Bay抑制劑對(duì)THP-1單核巨噬細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒害作用。
在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)LPS刺激后，THP-1單核巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-αmRNA（圖1a）和上清液中TNF-α（圖1b）的含量極顯著上升（P＜0.01）。與LPS刺激組相比，木犀草素及NF-κB抑制劑Bay均可顯著降低細(xì)胞內(nèi)TNF-αmRNA和上清液中TNF-α的表達(dá)，同Bay抑制劑類(lèi)似，木犀草素可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎活性，且5 μmol/L的木犀草素對(duì)TNF-α的抑制作用與10 μmol/L抑制劑Bay的抑制作用相當(dāng)（P＞0.05）。木犀草苷、葒草素、異葒草素均可顯著降低細(xì)胞中上清液中TNF-α的表達(dá)（圖1b）（P＜0.05，P＜0.01）。
IL-6是一種多效性的促炎因子。如圖2所示，經(jīng)過(guò)LPS刺激后，THP-1單核巨噬細(xì)胞上清液中IL-6濃度極顯著上升（P＜0.01），木犀草素和Bay均可極顯著抑制細(xì)胞內(nèi)IL-6mRNA和上清液中IL-6的表達(dá)（P＜0.01），且木犀草素對(duì)IL-6的抑制作用與抑制劑Bay相當(dāng)（P＞0.05）。木犀草苷、葒草素、異葒草素均可極顯著降低細(xì)胞中上清液中IL-6的表達(dá)（P＜0.01）。
IL-1β是IL-1的主要成分，是一種多功能的炎癥因子，主要表現(xiàn)在致炎和對(duì)組織的膠原降解的破壞作用。如圖3所示，LPS作用于THP-1單核巨噬細(xì)胞后，胞內(nèi)IL-1β濃度極顯著增高（P＜0.01）。木犀草素及其黃酮苷對(duì)IL-1β的抑制作用較其對(duì)TNF-α和IL-6的弱，木犀草素對(duì)細(xì)胞內(nèi)IL-1βmRNA的表達(dá)具有顯著抑制作用（P＜0.05），葒草素對(duì)細(xì)胞上清液液中IL-1β表現(xiàn)出顯著抑制作用（P＜0.05）。
由圖4可見(jiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組NF-κB抑制劑Bay的預(yù)處理可以抑制IκBα和IKKβ發(fā)生磷酸化，降低P-IκBα和P-IKKβ的含量。木犀草素、木犀草苷、葒草素、異葒草素均可以下調(diào)細(xì)胞中P-IκBα和P-IKKβ的產(chǎn)生，木犀草素及其黃酮苷對(duì)于抑制IκBα和IKKβ發(fā)生磷酸化具有較好的作用。
同樣通過(guò)計(jì)算相對(duì)比率分析抑制劑及黃酮類(lèi)化合物對(duì)LPS刺激下THP-1單核巨噬細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中P65的影響。LPS作用30 min后，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中P65較大程度地增加（圖5）。陽(yáng)性對(duì)照組NF-κB抑制劑Bay的預(yù)處理抑制了P65的生成，同時(shí)抑制了P65含量的核移位，這可以直接抑制NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的炎性介質(zhì)的表達(dá)。木犀草苷、葒草素和異葒草素也可以通過(guò)抑制P65入核而發(fā)揮抗炎活性。
LPS刺激后，較CK組相比，細(xì)胞中總Nrf2表達(dá)量降低，細(xì)胞核中Nrf2相對(duì)含量顯著減少，而細(xì)胞質(zhì)中Nrf2相對(duì)含量顯著增多，表明LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中，Nrf2發(fā)生核移位程度低，LPS刺激THP-1單核巨噬細(xì)胞建立的炎性細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)源Keap1-Nrf2抗氧化系統(tǒng)受到一定程度抑制。
Bay-11-7082作為NF-κB抑制劑可以顯著提高細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，但不能使表達(dá)的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)抗氧化系統(tǒng)，發(fā)揮抗氧化活性。而葒草素不僅可以顯著促進(jìn)細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，還可以顯著促進(jìn)Nrf2發(fā)生核移位；木犀草苷、異葒草素同Bay類(lèi)似，僅可促進(jìn)Nrf2的表達(dá)（P＜0.01）。
LPS增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，為增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性，HO-1表達(dá)增多（P＜0.01）。在作用12 h后，葒草素中HO-1表達(dá)量處于較低水平，可能是由于其通過(guò)顯著促進(jìn)細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，顯著促進(jìn)Nrf2發(fā)生核移位（圖6c、e），黃酮類(lèi)化合物發(fā)揮了一定的抗氧化活性，細(xì)胞內(nèi)氧化水平已經(jīng)得到控制（圖7b），因而細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)處于較低水平；木犀草素、木犀草苷、異葒草素3 種黃酮類(lèi)化合物對(duì)HO-1的表達(dá)具有下調(diào)作用，這可能是經(jīng)過(guò)黃酮類(lèi)化合物的預(yù)處理后，抑制了IκBα和IKKβ發(fā)生磷酸化反應(yīng)，直接抑制了NE-κB信號(hào)通路，較強(qiáng)程度上抑制了細(xì)胞內(nèi)炎性反應(yīng)（圖6），細(xì)胞氧化應(yīng)激水平不高，HO-1表達(dá)量較低。
木犀草素及其黃酮苷具有較好的抗炎活性，其中黃酮碳苷葒草素可以通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)控蛋白上游調(diào)控器P-IKKβ、上游調(diào)控蛋白IκBα的活性及下游調(diào)控蛋白P65的活性，下調(diào)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β，發(fā)揮較強(qiáng)的抗炎活性；同時(shí)葒草素通過(guò)促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和核移位發(fā)揮較好的抗氧化活性，IKKβ可能是葒草素抑制NF-κB信號(hào)通路并激活Nrf2發(fā)揮抗炎/抗氧化雙重生物活性的交叉靶點(diǎn)；葒草素較木犀草素發(fā)揮了更強(qiáng)的抗炎、抗氧化活性，原因可能是其較木犀草素具有更低的代謝速率和更高的生物利用度。