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薯蕷皂素（Diosgenin）來源于薯蕷科單子葉草質(zhì)纏繞藤本植物,如山藥、黃姜、黃藥子、穿山龍等的根莖,是生產(chǎn)氫化可的松、強(qiáng)的松、炔諾酮、膚輕松、地塞米松等多種甾體類藥物的重要基礎(chǔ)原料。研究表明,薯蕷皂素具有抗氧化、抗血管鈣化、抗腫瘤、抗炎、抗過敏、抗病毒和抗休克等作用。
薯蕷皂素在生殖方面的研究,報(bào)道甚少,有研究初步證實(shí),薯蕷皂素能夠改善輕度雄性衰老性生殖障礙,提高精子活性;但薯蕷皂素對(duì)睪丸支持細(xì)胞（Sertoli cells,SCs）作用的研究還未見報(bào)道。因此,進(jìn)一步研究薯蕷皂素對(duì)雄性生殖的影響,可能為男性不育防治提供新的思路。SCs在精子生成過程中,可以在近基底室建立一個(gè)提供結(jié)構(gòu)支撐、營養(yǎng)和免疫保護(hù)的獨(dú)特和重要的環(huán)境,具有營養(yǎng)支持、分泌、免疫豁免及吞噬等多種功能。由于雌激素在維持雄性生殖活動(dòng)中具有不可替代的作用。
SCs是未成熟動(dòng)物雌激素的主要來源,雌激素不僅可以直接促進(jìn)SCs的增殖、分化和成熟,而且可以通過間接影響促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone,FSH）的分泌,調(diào)節(jié)SCs有絲分裂;同時(shí),又由于雌激素主要是通過其受體（Estrogen receptor,ESR）信號(hào)通路來完成調(diào)控男性精子生成的作用。因此,研究薯蕷皂素對(duì)SCs的作用及其對(duì)ESR信號(hào)傳導(dǎo)途徑的影響,不僅為探討該藥治療男性不育的作用及機(jī)制,而且為其進(jìn)一步藥物研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第一部分:薯蕷皂素對(duì)SCs增殖的影響目的:通過觀察薯蕷皂素干預(yù)后,小鼠睪丸來源的SCs（TM4）細(xì)胞系的增殖、周期分布及凋亡,探討薯蕷皂素對(duì)SCs增殖的影響。
方法:
1)MTT法及Brdu法檢測薯蕷皂素干預(yù)后,SCs（TM4）的增殖情況。
2)流式細(xì)胞術(shù)及Western Blot法檢測薯蕷皂素干預(yù)后,SCs（TM4）的周期分布及G0/G1期標(biāo)志蛋白CDK4/CDK6、cyclin D1、CDK2、cyclin E與G2/M期標(biāo)志蛋白cdc2、cyclin B的表達(dá)。
3)TUNEL法及Western Blot法檢測薯蕷皂素對(duì)干預(yù)后,SCs（TM4）凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bax、AIF、Caspase 3、Caspase 9和Bcl-2的表達(dá)。
結(jié)果:
1)不同薯蕷皂素濃度均可促進(jìn)SCs（TM4）增殖（P<0.05）,以2.5μM最為顯著;2.5μM薯蕷皂素干預(yù)SCs（TM4）6-48 h,在6、12、24、48 h等不同時(shí)間點(diǎn)均可見細(xì)胞活力增加（P<0.05）,但以24h時(shí)達(dá)最大值。
2)2.5μM薯蕷皂素干預(yù)SCs（TM4）24h,G0/G1期細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P<0.05）,而S期的細(xì)胞群顯著增加（P<0.05）,G2/M期細(xì)胞群沒有顯著改變（P>0.05）;G0/G1期的標(biāo)志蛋白CDK4/CDK6、Cyclin D1、CDK2與Cyclin E表達(dá)明顯增加（P<0.05）,而G2/M期標(biāo)志蛋白cdc 2和Cyclin B表達(dá)無顯著影響（P>0.05）。CDKs抑制因子P27的表達(dá)稍有下降（P>0.05）。
3)2.5μM薯蕷皂素干預(yù)SCs（TM4）24 h,能顯著抑制細(xì)胞凋亡（P<0.05）;明顯抑制凋亡相關(guān)因子Bax、AIF、Cleaved Caspase3和Cleaved Caspase 9的表達(dá),增加Bcl-2蛋白表達(dá)（P<0.05）。
結(jié)論:薯蕷皂素能夠促進(jìn)小鼠SCs（TM4）的增殖,且存在一定的量效與時(shí)效關(guān)系;同時(shí)促進(jìn)其細(xì)胞周期過渡和抑制其凋亡。第二部分:薯蕷皂素調(diào)控ESR及其ERK/Akt信號(hào)通路促進(jìn)SCs增殖的機(jī)制目的:通過觀察薯蕷皂素對(duì)SCs（TM4）中ESR及其ERK/Akt信號(hào)通路的影響,探討其促進(jìn)SCs增殖的機(jī)制。
方法:
1)以2.5μM薯蕷皂素干預(yù),及在此基礎(chǔ)上分別加入1n M抗雌激素ICI和5n M酪氨酸激酶選擇性抑制劑PP2,Western Blot法檢測SCs（TM4）核和質(zhì)膜中的ESR1、ESR2的蛋白表達(dá)。MTT和Brdu標(biāo)記法、流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL法檢測SCs（TM4）的增殖、周期分布及凋亡。
2)薯蕷皂素干預(yù)SCs（TM4）后,及在薯蕷皂素干預(yù)的基礎(chǔ)上,分別加入ICI、PP2及ERK抑制劑U0126及和Akt抑制劑LY294002后,Western Blot法檢測不同時(shí)間點(diǎn)ERK和Akt磷酸化;MTT和Brdu標(biāo)記法檢測SCs（TM4）的增殖。
3)薯蕷皂素干預(yù)后,采用Wstern Blot法檢測SCs（TM4）細(xì)胞核上ESR表達(dá);熒光素酶報(bào)告基因檢測SCs（TM4）的ESR的轉(zhuǎn)錄活性。
4)CHIP檢測薯蕷皂素干預(yù)后,SCs（TM4）ESR的晚期活動(dòng)。
結(jié)果:
1)2.5μM薯蕷皂素干預(yù)SCs（TM4）0-30min,在5min、15min、30min時(shí)間點(diǎn)質(zhì)膜上ESR1和ESR2蛋白表達(dá)均有顯著升高（P<0.05）,在15min時(shí)達(dá)到最高;而核上ESR1和ESR2的蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）,在15min時(shí)達(dá)到最低。加入ICI和PP2時(shí),ESR1、ESR2細(xì)胞膜表達(dá)水平受到了顯著抑制（P<0.05）;而細(xì)胞核上ESR1、ESR2的核表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）。在加入ICI和PP2時(shí),薯蕷皂素促進(jìn)SCs（TM4）增殖的作用受到了顯著的抑制（P<0.05）;同時(shí),G0/G1期細(xì)胞群數(shù)量有明顯上升（P<0.05）,S期的細(xì)胞群數(shù)量有明顯下調(diào)（P<0.05）;細(xì)胞的凋亡有顯著增加（P<0.05）。
2)2.5μM薯蕷皂素干預(yù)SCs（TM4）0-30min,在5min、15min、30min時(shí)均可增加ERK、Akt磷酸化水平,15min時(shí)達(dá)到最高（P<0.05）。分別加入相關(guān)抑制劑ICI、PP2、U0126及LY294002時(shí),ERK、Akt磷酸化水平受到顯著抑制（P<0.05）;加入U(xiǎn)0126及LY294002時(shí),SCs（TM4）的細(xì)胞增殖降低（P<0.05）。
3)2.5μM薯蕷皂素干預(yù)0-48h,在12h、24h、48h時(shí)間點(diǎn)SCs（TM4）細(xì)胞核ESR1與ESR2的表達(dá)增加,其中以干預(yù)后24h增加最為顯著（P<0.05）;在此基礎(chǔ)上加入PP2時(shí),細(xì)胞核上ESR1、ESR2的核表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;同樣條件下,SCs（TM4）的ESR轉(zhuǎn)錄活性顯著增加（P<0.05）,以干預(yù)后24h增加最為顯著;而在加入抑制劑ICI、PP2、U0126和LY294002后SCs（TM4）的ESR轉(zhuǎn)錄活動(dòng)受到顯著抑制（P<0.05）。
4)2.5μM薯蕷皂素干預(yù)SCs（TM4）后ESR1、ESR2蛋白分子與Cyclin D1及Bcl-2基因結(jié)合水平增高顯著（P<0.05）。
結(jié)論:薯蕷皂素促進(jìn)SCs（TM4）增殖機(jī)制:干預(yù)后激活依賴于SRC誘導(dǎo)的即時(shí)和瞬態(tài)ESR核質(zhì)膜易位,隨后激活ERK/Akt信號(hào)通路,后期通過活化核ESR的轉(zhuǎn)錄活性和直接調(diào)控細(xì)胞周期因子cyclin D和細(xì)胞凋亡因子Bcl-2,從而促進(jìn)G1期到S期的細(xì)胞周期過渡和抑制細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖。
【1】吳雷濤. 薯蕷皂素調(diào)控ESR及其ERK/Akt信號(hào)通路促進(jìn)SCs增殖的機(jī)制研究[D].第四軍醫(yī)大學(xué),2015.