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桃兒七（Sinopodophyllum hexandrum(Royle) Ying） 是小檗科桃兒七屬多年生草本植物，植株高20-50厘米早在 1992 年桃兒七就被《中國植物紅皮書》收錄。“桃兒七”屬于“太白七藥”之一，具有神奇的抗癌作用，其根和根莖中含有大量的具有抗癌活性的木脂素類物質，其中鬼臼毒素 (podophyllotoxin) 抗癌活性最高，是合成GP7，VP216(etoposide) 和 VM 226 (teniposide) 等抗癌藥物的起始物。由于根狀莖與果實入藥，而被任意采挖，天然繁殖能力較弱，隨著植被的破壞而導致其生長環(huán)境的改變，植株日益稀少，分布區(qū)日漸縮減。
目前許多臨床藥物是通過天然的植物代謝物合成的，但是只有一小部分植物代謝物的合成通路是已知的，這就成為這些天然代謝物的批量化生產的限制條件。鬼臼毒素是一種木酚素，是抗腫瘤藥物依托泊苷的前體，本身并沒有拓撲異構酶抑制劑功能，但經過一系列化學修飾后形成的依托泊甙具有拓撲異構酶抑制劑活性，能夠發(fā)揮抗腫瘤作用，合成通路只有部分是已知的，目前只能依靠天然的植物產生的代謝物合成依托泊苷。因此，完整的鬼臼毒素的合成通路將有助于幫助依托泊苷的工廠化生產。
研究材料：物理損傷的離體桃兒七的健壯葉片
技術平臺：LC-MS，RNA-seq，轉基因
1）利用LC-MS檢測方法，檢測物理損傷后不同時間的桃兒七種鬼臼毒素的含量，發(fā)現(xiàn)葉片受傷后在12，24h后鬼臼毒素含量達到最大；
2）根據LC-MS檢測結果，對桃兒七葉片進行轉錄組測序，取樣時間0，3，9，12h，每個樣品三個重復，根據轉錄組信息及公共數據篩選與鬼臼毒素合成相關的基因；
3）利用轉基因的方法，將候選基因轉到煙草葉片中，并利用LC-MS方法檢測煙草葉片中代謝物含量的變化，找到鬼臼毒素合成通路的調控基因。
在鬼臼毒素的生物合成通路中，前期的基因是已知的。如圖1所示，DIR，PLR，SDH，CYP719A23這4個鬼臼毒素合成相關的前期基因是已知的。后期基因及中間代謝物通路不清楚，但是合成通路中的已知亞太因（yatein）和去氧鬼臼毒素（deoxypodophyllotoxin）以及鬼臼毒素是已知的。作者利用公共數據庫中的桃兒七鬼臼毒素相關轉錄組信息進行分析發(fā)現(xiàn)，DIR，PLR，SDH，CYP719A23這4個基因都是高表達的。選擇公共數據庫中與已知基因具有相似表達的候選基因，篩選到4個O-甲基轉移酶（OMT1-4）基因，12個細胞色素P450（CYP）基因和2個氧代戊二酸/ Fe（II）-依賴性雙加氧酶（2-ODD）基因。
下一步作者利用代謝組及轉基因的方法進行基因的驗證。用含有羅漢松樹脂酚（（-）-matairesinol）培養(yǎng)基培養(yǎng)煙草離體葉片，將上文中預測到的基因分別與CYP719A23轉到煙草葉片中。利用LC-MS方法檢測轉入以上基因1d后葉片，發(fā)現(xiàn)只有轉入OMT3基因的葉片中pluviatolide被大量消耗，說明OMT3控制合成pluviatolide的下一個產物，經解譜分析，產物為（-）-5’-desmethoxy-yatein。將剩余的候選基因分別與CYP719A23和OMT3轉入到含有羅漢松樹脂酚（（-）-matairesinol）培養(yǎng)基培養(yǎng)煙草離體葉片，經LC-MS檢測并未發(fā)現(xiàn)（-）-5’-desmethoxy-yatein的消耗。
作者前期的實驗發(fā)現(xiàn)，損傷桃兒七葉片后鬼臼毒素的含量急劇升高，利用LC-MS檢測發(fā)現(xiàn)鬼臼毒素及其前體物質在12,24h含量達到最高。利用RT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)與鬼臼毒素合成相關的前期5個基因表達量在9h達到最高（圖2）。
圖2 物理損傷后已知鬼臼毒素合成基因RT-PCR結果
根據已知的結果，作者對受傷的桃兒七葉片進行轉錄組測序，處理時間為受傷后0，3，9，12h，每個處理三個重復，共12個樣品。對轉錄組數據進行分析，根據推測鬼臼毒素合成需要用到的酶有四種，分別為O-甲基轉移酶（O-methyltransferase，OMT），細胞色素P450（cytochromes P450，CYP），2-氧化戊二酸/Fe(II)依賴的雙加氧酶（2-oxoglutarate/Fe(II)-dependent dioxygenase，2-ODD），以及多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO），通過尋找與這四種酶家族同源的基因找到，336個，對這336個基因進行層次聚類分析得到91個表達模式相同的基因，對91個基因進行表達量分析，找到22個高表達基因，這22個基因中包含有7個具有已知酶功能的基因，其中一個基因為OMT3（圖3）。
圖3 22個高表達基因的聚類圖
標黑的為已知鬼臼毒素合成基因，紅色為篩選的7條候選基因
下一步作者的工作是對這6條候選基因進行驗證如圖4所示。6個候選基因分別與CYP719A23和OMT3轉移到用含有(-)-matairesinol培養(yǎng)基培養(yǎng)4d后煙草葉片中去，1d后利用LC-MS方法檢測鬼臼毒素合成相關代謝物含量。通過對含有6種候選基因葉片的LC-MS比較分析，發(fā)現(xiàn)在含有CYP71CU1基因的Phex524樣品中觀察到(-)-5’-desmethoxy-yatein（5’去甲氧基亞太因）含量的變化，并通過質譜鑒定發(fā)現(xiàn)了一個高含量的物質，為(-)-5’-desmethyl-yatein（5’去甲基亞太因）。為了完成(-)-yatein（合成鬼臼毒素的中間產物）的合成通路，將剩余的5個基因與CYP719A23,OMT3,和CYP71CU1，分別轉移到含有(-)-matairesinol培養(yǎng)基培養(yǎng)煙草葉片中去。對這些葉片進行LC-MS分析，結果發(fā)現(xiàn)含有OMT1基因的葉片未檢測到(-)-5’-desmethoxy-yatein（5’去甲氧基亞太因），但是檢測到了(-)-yatein（亞太因）的高表達，說明OMT1基因誘導(-)-5’-desmethyl-yatein（5’去甲基亞太因）產生(-)-yatein(亞太因)。在yatein（亞太因）到deoxy-podophyllotoxin（脫氧鬼臼毒素）的合成路徑中，涉及到了芳基四氫萘骨架中的中心六元環(huán)閉合和氧化修飾。在上一步的試驗中，檢測到了含有2-ODD的樣品中的(-)-5’-desmethoxy-yatein（5’去甲氧基亞太因）大量消耗，對應產生了5’-desmethoxy-deoxy-podophyllotoxin（5’去甲基脫氧鬼臼毒素）。我們假設反應機制涉及通過羥基化，隨后脫水和碳-碳鍵形成活化7’碳，通過醌甲基化物中間體形成。因此假設2-ODD可以將yatein（亞太因）合成到(-)-deoxy-podophyllotoxin（脫氧鬼臼毒素）。于是作者將2-ODD，CYP719A23，OMT3，CYP71CU1和OMT1一起轉移到煙草葉片中，經過LC-MS檢測發(fā)現(xiàn)葉片中yatein（亞太因）被大量消耗而(-)-deoxy-podophyllotoxin（脫氧鬼臼毒素）含量增加，因此可以確定2-ODD基因可以促進生成(–)-deoxy-podophyllotoxin。為了驗證(-)-deoxy-podophyllotoxin（脫氧鬼臼毒素）到podophyllotoxin（鬼臼毒素）生物合成通路，將公共數據庫里6個CYP候選基因分別于其他幾個已經確定的基因轉移到煙草葉片中，經過LC-MS分析發(fā)現(xiàn)，6種類型的葉片均未發(fā)現(xiàn)podophyllotoxin（鬼臼毒素）合成，但是意外的是作者發(fā)現(xiàn)轉移CYP71BE54基因的葉片(-)-deoxy-podophyllotoxin（脫氧鬼臼毒素）被大量消耗，而檢測到大量的(-)-4’-desmethyl-deoxy-podophyllotoxin（4’去甲基脫氧鬼臼毒素）。在篩選其他的基因是發(fā)現(xiàn)CYP82D61能夠使得 (-)-4’-desmethyl-deoxy-podophyllotoxin（去甲基脫氧鬼臼毒素）大量消耗，得到(–)-desmethyl-epipodophyllotoxin（去甲基表鬼臼毒素）。雖然沒有產生podophyllotoxin（鬼臼毒素）但是產生了podophyllotoxin（鬼臼毒素）的差異構象體（表鬼臼毒素）。而表鬼臼毒素與抗癌藥物依托泊甙結構更相近，僅需一步化學修飾就可以合成依托泊甙。
圖4 轉入相應基因后matairesinol培養(yǎng)基內煙草葉片中鬼臼毒素中間代謝物的含量
為了驗證整個結果的準確性，作者將10個基因一起轉入到含有（+）-pimoresinol的培養(yǎng)基內培養(yǎng)，并利用LC-MS檢測鬼臼毒素合成通路代謝物含量，結果中發(fā)現(xiàn)了(–)-4′-desmethylepipodophyllotoxin（4’去甲氧基表鬼臼毒素），而其他對照試驗，只轉入10個基因，或轉入GFP+（+）-pimoresinol的均為檢測到(–)-4′-desmethylepipodophyllotoxin（4’去甲氧基表鬼臼毒素）的生成如圖5。
圖5 B 不同條件處理下的煙草葉片LC-MC提取離子流圖（箭頭代表(–)-4′-desmethylepipodophyllotoxin糖苷配基）C 不同處理條件下檢測到的 (–)-4′-desmethylepipodophyllotoxin含量
最終，作者完成了鬼臼毒素完整的合成通路，并且實現(xiàn)了體外煙草中鬼臼毒素的合成。