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541-15-1 / 左旋肉堿的純化方法和含量檢測

背景及概述[1]

左旋肉堿(L-carnitine),也叫L-肉堿,音譯卡尼丁,是一種促使脂肪轉化為能量的類氨基酸,是乳粉中一種營養成分,因其是一種類維生素營養素,也將其命名為維生素Bt。

左旋肉堿的純化方法和含量檢測

含量檢測[1]

1、試劑準備

高氯酸溶液(13%):13mL高氯酸稀釋至100mL。

氫氧化鈉溶液(10mol/L):稱取40g氫氧化鈉用水溶解,冷卻后稀釋至100mL。

氫氧化鉀溶液(4.0mol/L):稱取22.4g氫氧化鉀用水溶解,冷卻后稀釋至100mL。

顯色儲備液:分別稱取50mg2-硝基苯甲酸、5.96gN-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg乙二胺四乙酸二鈉溶于30mL去離子水中,用10mol/LNaOH溶液調pH至7.4~7.6,然后用水定容至50mL。此液置于4℃冰箱中可保存3個月。

顯色工作液:吸取5.0mL顯色儲備液用水定容至25mL。

乙酰輔酶A(AcetylCoA)溶液:20.0mg乙酰輔酶A溶于2.0mL水中。臨用時配制。

乙酰肉堿轉移酶(CAT)溶液:吸取10μL乙酰肉堿轉移酶懸浮液,經1500r/min離心10min,棄去上層清液,沉淀用0.2mL水溶解。臨用時配制。

左旋肉堿標準品,sigma,純度99%。配制成5個濃度備用,現配現用,分別是1.6,3.2,6.4,9.6,16ug/ml。

2、儀器

分析天平:萬分之一。

pH計:精度0.01。

離心機:轉速≥1500r/min。

恒溫水浴鍋:溫度可控制在40℃±2℃。

酶標儀405nm及配套的96孔酶標板。

3、樣品處理

準確稱取2.5g混合均勻的試樣于帶刻度的50ml離心管中,用15mL40℃溫水溶解。加入5mL13%高氯酸溶液,混合均勻后靜止20min。用蒸餾水定容至刻度,混勻,用定量濾紙過濾。

取濾液20mL,用4mol/L氫氧化鉀溶液調pH為12.5~13.0后,置于40℃水浴60min。冷卻后用13%高氯酸調pH為7.0~7.5。將樣液轉入50mL容量瓶中,用蒸餾水定容。混勻后置于4℃冰箱中過夜。將試樣處理液從冰箱中取出放置至室溫,取上清液測定。

4、分析測定

在酶標板上設置標準孔5個(1.6,3.2,6.4,9.6,16)和樣品孔,最好雙孔平行測試;

取200ul標品或樣品加入到相應的微孔中;

加入80ul底物到各個孔,加入10ul輔酶A到各個孔。輕輕混勻,立刻開始計時5分鐘,室溫;

在405nm讀取吸光度OD1;

每孔加入10ul轉移酶溶液,混勻(輕輕攪拌效果好),計時10分鐘,室溫;

用酶標儀405nm測試吸光度OD2。

5、結果計算

用吸光度差(OD2-OD1)作縱坐標,濃度值為橫坐標,作圖,從圖中讀出樣品濃度,乘以稀釋倍數(稀釋倍數50)得最終結果。

純化方法[2]

取100g左旋肉堿粗品于100mL添加0.1%甲酸甲酯的甲醇中,于-30℃下攪拌1小時使之混合均勻,過濾,除去不溶于該有機溶劑的沉淀物,并用貯藏于0℃下的甲醇洗滌沉淀物3次,濾液合并入左旋肉堿溶液,真空減壓濃縮除去有機溶劑,即得左旋肉堿純品。

經檢測,該左旋肉堿產品化學純度為97%。

參考文獻

[1][中國發明]CN201810498612.6一種乳粉中左旋肉堿含量的檢測方法

[2][中國發明]CN201510850786.0一種左旋肉堿粗品的純化除鹽方法

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