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左旋肉堿或L-肉堿，別稱L-肉毒堿或維生素BT，其化學(xué)名稱為β-羥基γ-三甲銨丁酸，是一種白色晶狀體或白色透明細粉。肉堿的研究始于20世紀初期。1905年，俄國人Gulewitsch和Krimberg從肉類提取物中發(fā)現(xiàn)了L-肉堿。自此以后，各國科學(xué)家進行了深入的研究，早期的研究發(fā)現(xiàn)，L-肉堿是一種類維生素營養(yǎng)素，并將其命名為維生素BT。而事實上，肉堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于膽堿，與氨基酸相近；另外，由于一些動物可由自身合成來滿足肉堿的需要，因此認為肉堿不是維生素，但習(xí)慣上仍將其稱為維生素BT。實驗表明L-肉堿是一種必需營養(yǎng)素，1985年在芝加哥召開的國際營養(yǎng)學(xué)術(shù)會議上，將左旋肉堿指定為“多功能營養(yǎng)品”。
取市場上采購的手性配體S-BINAP(0.535g，0.85mmol)和釕化合物[Ru(p-cymene)Cl2]2(0.29g，0.47mmol)于三頸瓶中，在N2保護下加入無水乙醇60mL和CH2Cl220mL，升溫至50-60℃攪拌反應(yīng)20h，減壓除溶劑后，得0.87g紅棕色產(chǎn)物[RuCl(cymene)(S-BINAP)]Cl[氯代[(S)-(-)-2，2′-雙(二苯基膦)-1，1′-聯(lián)萘](p-傘花素)氯化釕(II)]。
取80g的4-氯乙酰乙酸乙酯于裝備聚四氟襯管的高壓釜中，將高壓釜封閉好后，用5kgf/cm2的純H2(99.99％)洗高壓釜10余次后，向高壓釜中充氫待用。在H2氣氛下將催化劑[RuCl(cymene)(S-BINAP)]Cl(30mg)溶解于300mL的乙酸乙酯溶液中，用注射器小心將其加入高壓釜中，繼續(xù)充氫至5kgf/cm2后，升溫至80℃左右，靜置約20min后，開始攪拌，在此溫度下反應(yīng)6h后，停止反應(yīng)，取出物料后經(jīng)減壓蒸餾除去低級烷基酯類溶劑即得高純度產(chǎn)品。經(jīng)GC分析產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化率大于99％，ee值96％。
取上述產(chǎn)物-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(4.5g)于圓底燒瓶中，加入33％Me3N20mL，用翻口橡皮塞密封，升溫至80℃，攪拌反應(yīng)5h，停止反應(yīng)，減壓蒸餾除去未反應(yīng)的Me3N后，加入10％的鹽酸溶液40mL，繼續(xù)在100℃下攪拌反應(yīng)6h，冷至室溫，加入CH2Cl220mL，室溫下攪拌過夜，分離收集水溶液，真空旋干，得棕褐色粘稠狀粗產(chǎn)物。
取預(yù)先制備好的陰離子交換樹脂約200-300mL，參照硅膠濕法裝好樹脂柱，在頂層小心放置一層玻璃纖維，將上述粘稠狀粗產(chǎn)物倒入裝好的柱中，用去離子水淋洗，控制滴液速度大約為1-2mL/min，當(dāng)流出溶液的pH＞8時開始收集，收集至流出液的pH約為8時停止收集。將所得的溶液減壓抽干。用乙醇/丙酮(1/7)重結(jié)晶，得到無色針狀晶體(左旋肉堿)，將所得肉堿產(chǎn)品于60-80℃下真空干燥1-2小時即得純品，產(chǎn)量4.0g，收率為86％。測定上述所得產(chǎn)品的比旋光度為，[α]D23-30.1。
高氯酸溶液(13％)：13mL高氯酸稀釋至100mL。
氫氧化鈉溶液(10mol/L)：稱取40g氫氧化鈉用水溶解，冷卻后稀釋至100mL。
氫氧化鉀溶液(4.0mol/L)：稱取22.4g氫氧化鉀用水溶解，冷卻后稀釋至100mL。
顯色儲備液：分別稱取50mg2-硝基苯甲酸、5.96gN-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg乙二胺四乙酸二鈉溶于30mL去離子水中，用10mol/LNaOH溶液調(diào)pH至7.4～7.6，然后用水定容至50mL。此液置于4℃冰箱中可保存3個月。
顯色工作液：吸取5.0mL顯色儲備液用水定容至25mL。
乙酰輔酶A(AcetylCoA)溶液：20.0mg乙酰輔酶A溶于2.0mL水中。臨用時配制。
乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶(CAT)溶液：吸取10μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶懸浮液，經(jīng)1500r/min離心10min，棄去上層清液，沉淀用0.2mL水溶解。臨用時配制。
左旋肉堿標準品，sigma，純度99％。配制成5個濃度備用，現(xiàn)配現(xiàn)用，分別是1.6，3.2，6.4，9.6，16ug/ml。
分析天平：萬分之一。
pH計：精度0.01。
離心機：轉(zhuǎn)速≥1500r/min。
恒溫水浴鍋：溫度可控制在40℃±2℃。
酶標儀405nm及配套的96孔酶標板。
準確稱取2.5g混合均勻的試樣于帶刻度的50ml離心管中，用15mL40℃溫水溶解。加入5mL13％高氯酸溶液，混合均勻后靜止20min。用蒸餾水定容至刻度，混勻，用定量濾紙過濾。
取濾液20mL，用4mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)pH為12.5～13.0后，置于40℃水浴60min。冷卻后用13％高氯酸調(diào)pH為7.0～7.5。將樣液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容。混勻后置于4℃冰箱中過夜。將試樣處理液從冰箱中取出放置至室溫，取上清液測定。
在酶標板上設(shè)置標準孔5個(1.6，3.2，6.4，9.6，16)和樣品孔，最好雙孔平行測試；
取200ul標品或樣品加入到相應(yīng)的微孔中；
加入80ul底物到各個孔，加入10ul輔酶A到各個孔。輕輕混勻，立刻開始計時5分鐘，室溫；
在405nm讀取吸光度OD1；
每孔加入10ul轉(zhuǎn)移酶溶液，混勻(輕輕攪拌效果好)，計時10分鐘，室溫；
用酶標儀405nm測試吸光度OD2。
用吸光度差(OD2-OD1)作縱坐標，濃度值為橫坐標，作圖，從圖中讀出樣品濃度，乘以稀釋倍數(shù)(稀釋倍數(shù)50)得最終結(jié)果。
本方法對國標法進行了改進，使得左旋肉堿測定更加快捷方便。一是本方法所用到的試劑屬于酶類制劑，價格比較高，用酶標板孔進行反應(yīng)所需的試劑量是原來的十分之一，可以大大節(jié)約關(guān)鍵試劑的用量及成本。二是本發(fā)明方法可以一次性測試96孔的吸光度，節(jié)省很多時間，而分光度計每次只能測一個樣的吸光度值，因而能達到一個快速檢測的目標，例如測定10個樣品時，本發(fā)明方法相對國標法可以節(jié)省210分鐘。
[1][中國發(fā)明,中國發(fā)明授權(quán)]CN201210089733.8一種左旋肉堿的制備方法
[2][中國發(fā)明]CN201810498612.6一種乳粉中左旋肉堿含量的檢測方法