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56-87-1/賴氨酸檢測方法匯總

賴氨酸是世界上僅次于谷氨酸的第二大氨基酸品種,目前主要應用于飼料添加劑、食品添加劑和醫藥中間體。賴氨酸是人體必需而又無法自身合成的第一限制性氨基酸,有 “第一缺乏氨基酸 ” 之稱 , 是海洋降壓藥 “藻白金 ” 的主要合成原料。賴氨酸在維持體內酸堿平衡,合成核蛋白、血紅蛋白 、促進大腦神經細胞的再生、參與脂肪代謝、提高機體抵抗力、保持人體氮平衡等生理活動中發揮著重要作用。 隨著科技的發展,賴氨酸品種已經發展出賴氨酸鹽酸鹽、蛋白賴氨酸和液體賴氨酸等 。

目前常用的賴氨酸檢測方法主要有甲醛滴定法 、高效液相色譜(HPLC)、化學法(茚三酮)法和西爾曼科技酶電極法。

一、滴定法

1.原理:供試品加醋酸汞試液使溶解后,再加入冰醋酸,賴氨酸上的兩個氨基與高氯酸反應,按照電位滴定法,用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定,記錄高氯酸滴定液的使用量,計算,即得。

2.步驟:

精密稱取供試品80mg,加醋酸汞試液5mL使溶解后,加冰醋酸25mL,照電位滴定法,用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定,并將滴定的結果用空白試驗校正,記錄消耗高氯酸滴定液的體積數(mL),每1mL高氯酸滴定液(0.1mol/L)相當于9.133mg的鹽酸賴氨酸(C6H14N2O2·HCl ),即得。

注1:“精密稱取”系指稱取重量應準確至所稱取重量的千分之一,“精密量取”系指量取體積的準確度應符合國家標準中對該體積移液管的精度要求。

二、HPLC

1.原理:采用鄰苯二醛(OPA)衍生化,采用高效液相色譜-紫外檢測法對衍生物進行檢測

2.步驟:

(1)樣品的配制 :量取賴氨酸鹽酸鹽注射液適量(應使所得測定液的濃度在 400 ~ 500 μg/mL 范圍內),用與上述相同的 70 %乙醇稀釋至刻度,混勻;

(2)樣品的衍生:量取 0.15 %OPA 溶液 2 mL 置于具塞玻璃反應管內 ,加 0.5 mL 按上述方法配制的測定液, 密塞后混勻管內液體 , 將反應管置于沸水浴中加熱1 min ,取出后立即冷卻至室溫 ,進樣 10 μL 至液相色譜儀中,在326 nm下檢測。

賴氨酸檢測方法匯總

三、茚三酮法

1.原理:賴氨酸和茚三酮在弱酸性條件下共熱可以生成紫紅色物質 , 且其顏色隨賴氨酸濃度的變化而改變。

2.步驟

(1.)制作標準曲線 配制不同濃度的賴氨酸溶液 , 加入 1.0mLpH為 6.0 的醋酸鹽緩沖溶液和 1.0mL茚三酮試劑 ,水浴加熱 15min, 冷卻 10min后定容, 在 570nm處測定其吸光度 , 濃度和吸光度關系曲線。

(2)準確量取 2.0mL賴氨酸溶液, 加入一定量的緩沖溶液和茚三酮試劑, 水浴加熱, 冷卻后定容至 25mL, 在 570nm處測定其吸光度。

四、酶電極法

1.原理:主要是通過賴氨酸在特異的氧化酶催化下發生氧化還原反應,其電子產物在生物傳感器電極表面形成電流從而進行測定。

2. 步驟:(1)樣品的前處理:根據檢測目的選擇是否水解樣品,將試樣溶于水,做一定稀釋最終樣品賴氨酸濃度控制在0—200mg/ml

(2)樣品的檢測:將樣品放入樣品盤,選擇樣品編號,設置檢測次數,點擊測試,20秒檢測完成后自動打印檢測結果。

五、總結

高氯酸定法測定根據滴定終點時高氯酸的消耗量來計算賴氨酸濃度誤差較大。茚三酮方法基本原理為:氨基酸與水合茚三酮共同加熱后可發生氧化脫氨反應,生成 NH3 與酮酸 ;加熱過程中酮酸裂解,放出 CO2,自身變為少一個碳的醛,水合茚三酮變為還原型茚三酮。NH3 與水合茚三酮及還原茚三酮脫水縮合,生成藍紫色化合物。傳統的茚三酮檢測方法無法排除雜質氨基酸的干擾且反應過程中易受 pH 和溫度變化的影響,造成測定結果準確性降低。HPLC 方法采用 2,4-二硝基氟苯(DNFB)、1-氟-2,4-二硝基苯基 -5-L-丙氨酰胺(FDAA)等衍生化試劑,雖然能夠精確區分和測定D-/L-型賴基酸的含量,但對儀器精密度和操作人員要求極高,并且易受樣品中雜質成分的干擾,完成一個全分析費時 25min,賴氨酸衍生物的流出時間為 14 min,費時費力費錢!酶電極法利用酶的催化反應,具有反應快速、專一性強等特點,利用酶的固定化可以重復利用酶耗材,達到低成本、快速檢測的目的。

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