572924-54-0 / 雷帕霉素的制備

背景及概述^[1][2]

雷帕霉素(Rapamycin)現稱為西羅莫司(Sirolimus)，是1975年由Veniza等分離得到的吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)所產的大環內脂類抗生素。經過多年的研究雷帕霉素現已被開發成為臨床使用的強效免疫抑制劑。同時以雷帕霉素為前體，化學修飾合成所得的一些結構新穎衍生物，被發現在免疫抑制、抗癌、抗帕金森氏癥與艾滋病等方面上，具有新的治療作用，其中其合成物Temsirolimus、Everolimus、AP23573已作為抗腫瘤靶向新藥物進行臨床研究，雷帕霉素在醫藥應用領域具有廣泛前景。

雷帕霉素

制備^[2]

當前雷帕霉素的生產主要通過發酵法生產，如中國發明專利申請公布書CN101486976A所述一般西羅莫司發酵效價只有200μg/ml左右，發酵副產物較多，導致后序提取時的層析分離比較困難，工作較為復雜，酵培養的發酵液經過濾得菌體后經甲醇萃取濃縮后，再通過一系列純化工藝如色譜層析、萃取、結晶等獲得西羅莫司純品，產品收率低于20％。所以該說明書公開了一種吸水鏈霉菌及其應用的技術方案，提供了一種高單位的西羅莫司產生菌，效價為600μg/ml以上，但是產品收率只達到了30～35％。

CN102443012A公布了一種高純度提取純化方法a.用丙酮或乙醇抽提發酵液過濾后得到的菌絲體，得到抽提液后，真空濃縮得濃縮抽提液；b.用乙酸乙酯萃取發酵液過濾后得到的上清液，分離乙酸乙酯相得萃取液，真空濃縮得濃縮萃取液；c.將a中的濃縮抽提液和b中的濃縮萃取液合并得濃縮液，并加入到裝有大孔樹脂的床層進行吸附，用丙酮和水的混合溶液作為洗滌劑洗滌大孔樹脂，收集洗脫液并真空濃縮，得濃縮洗脫液；d.用乙酸乙酯萃取c得到的濃縮洗脫液，經無水硫酸鈉或無水硫酸鎂脫水后真空濃縮得濃縮液，上樣硅膠柱進行層析分離，正庚烷和丙酮混合溶液作為洗滌劑洗滌硅膠柱，正庚烷和丙酮混合溶液作為洗脫劑洗脫硅膠柱，收集洗脫液并真空濃縮得濃縮液；e.將步驟d得到的濃縮液溶于石油醚或乙醚中結晶，干燥得到雷帕霉素粗品。f.丙酮溶解雷帕霉素粗品，真空濃縮后用乙醚重結晶，干燥得到雷帕霉素純品。

楊國新等在《海峽藥學》(2007年，第19卷第17期，25-26頁)文獻中公開：發酵液經離心后得到菌絲體，菌絲體用兩倍量體積的95％酒精分別浸泡兩次，離心棄菌絲渣，合并酒精浸泡液，減壓濃縮去除酒精。殘留液用等體積的乙酸乙酯分別萃取兩次，合并乙酯層并用飽和NaCl溶液洗滌1次，經無水Na2SO4干燥1h后，過濾，減壓濃縮除去乙酸乙酯得上柱物。上柱物溶于適當體積的洗脫劑(乙酯-石油醚洗脫系統)，200～300目硅膠柱層析，分段收集，HPLC檢測，合并含西羅莫司的洗脫液，減壓濃縮，濃縮液經乙醚結晶，洗晶，結晶。經上述制備的西羅莫司結晶溶于少量的洗脫劑，硅膠(200～300目)柱層析分離，分部收集，分離過程用高效液相跟蹤檢測。合并含西羅莫司的洗脫液，減壓濃縮，濃縮液經乙醚結晶，洗晶，重結晶得高純度西羅莫司樣品。

美國專利公布說明書US20100029933A1公布了雷帕霉素的純化技術方案，該方案從發酵液中純化得到純品純度達到98.8％，總雜質含量小于1.2％，單雜低于0.15％，提純方案為a)用疏水性溶劑萃取發酵液中的雷帕霉素并濃縮b)加入親水性的溶劑分離雜質；c)將步驟得到的產物吸附到惰性載體上，用堿和酸連續洗滌，然后洗脫；d)收集步驟c得到的洗脫液或直接用步驟b中含雷帕霉素的溶液，上硅膠柱，收集洗脫液；e)將步驟d)得到的產物結晶；f)溶解f步驟中的結晶品，進行疏水作用或反相色譜；并將g重結晶得到的高哦純度的雷帕霉素但是利用該方法純化收率不高，在一個具體實例中可以得知11kg的雷帕霉素發酵液最后的純品只有6g，稱取3g純品進一步純化結晶得到2.5g。

朱健等在中國醫藥工業雜志發表的文章《他克莫司產生菌的選育和生產工藝研究》中公開了采用發酵液板框所得菌體丙酮浸泡，抽提液濃縮或加水稀釋使丙酮濃度<50％(V/V)，用大孔吸附樹脂吸附，低濃度的丙酮解析，再以高濃度丙酮解析。濃縮脫除丙酮，雷帕霉素不溶于水而形成沉淀，沉淀用乙醇溶解后結晶。初次結晶得到的純度約為90％，乙醇重結晶1～2次后，純度可提高至95％。

藤澤藥業工業公司(徐親民.他克莫司的工業化研究[J].國外醫藥抗生素分冊,2000,21(4):151-155)報道采用主要工藝為收集菌絲體，丙酮浸泡，濃縮，經過DiaionHP20樹脂處理，洗脫液濃縮后乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮后經過酸性硅膠柱層析，再次經普通硅膠層析，最后通過乙腈重結晶得到產品。

主要參考資料

[1]郝俊, 曹國番, 楊潔, 楊懿銘, 李振華, & 楊燕等. (2012). 雷帕霉素對人cd4+cd25+調節性t細胞體外擴增的影響. 現代免疫學, 032(005), 404-411.

[2] 楊震坤, 沈衛峰, 張瑞巖, 張建盛, 胡健, & 張奇等. (2006). 雷帕霉素洗脫支架治療冠狀動脈慢性完全性閉塞病變. 中國循環雜志, 021(002), 110-112.

[3] 陸莉, & 林志彬. (2001). 一種新型的免疫抑制劑--雷帕霉素. 中國藥學雜志, 036(009), 643-645.