634-01-5 / 腺苷-2′,3′-環磷酸的制備方法

背景及概述^[1]

環形核苷酸是細胞內重要的第二信使，參與細胞內多種信號轉導途徑的調控。現已知發現的第二信使包括環形腺苷單磷酸(3′,5′-cAMP)、環形鳥苷單磷酸(3′,5′-cGMP)、環形胞苷單磷酸(3′,5′-cCMP)、環形尿苷單磷酸(3′,5′-cUMP)、環形二鳥苷酸(c-di-GMP)，環形二腺苷酸(c-di-AMP)及環形鳥苷腺苷酸(cGAMP)。除了上述已發現的環形核苷酸類第二信使外，在2009年埃德溫(Edwin)等人還首次在人的腎臟細胞中發現了腺苷-2',3'-環磷酸(2′,3′-cAMP)，隨后人們又在哺乳動物的大腦等組織細胞中發現了腺苷-2',3'-環磷酸的存在。科研人員還從植物細胞中檢測到腺苷-2',3'-環形單磷酸和鳥苷-2',3'-環磷酸(2′,3′-cGMP)，從一株熒光假單胞菌中檢測到胞苷-2',3'-環磷酸(2′,3′-cCMP)和尿苷-2',3'-環形單磷酸(2′,3′-cUMP)的存在。現有的研究結果表明，這四種2′,3′-環形核苷單磷酸很可能代表了另外一類新型的生物細胞第二信使。由于2′,3′-環形核苷單磷酸吸引了越來越多的關注，其在科學研究和醫學上的需求也日益增多。目前2′,3′-環形核苷單磷酸的制備均采用化學合成的方法，尚未有生物制備方法。化學合成法生產2′,3′-環形核苷單磷酸，產量低，價格高，在一定程度上限制了其開發應用。

制備^[1]

步驟1：2′,3′-環形核苷單磷酸混合物的提取

(1)將洗脫得到的目的蛋白LfliZ，0℃靜置3d，此時蛋白溶液將會出現明顯的沉淀。將蛋白溶液12000rpm離心20min，得到上清液；

(2)將步驟(1)中得到的上清液，用截留分子量為3K的超濾管超濾，去除殘留的蛋白，超濾膜濾過液即為含有4種2′,3′-環形核苷單磷酸溶液；

步驟2：四種環形核苷酸腺苷-2',3'-環磷酸，2′,3′-cGMP，2′,3′-cCMP和2′,3′-cUMP純品的提取

(1)將得到的2′,3′-環形核苷單磷酸溶液，采用C18反向色譜柱進行高效液相色譜分離得到四種2′,3′-環形核苷單磷酸純品；所用的流動相為：A液，10mM醋酸銨溶液，pH5.0；B液，75％A液加入25％甲醇；

(2)上述步驟中所用的分離程序為：0min，B液0％；2.5min，B液0％；5min，B液30％；10min，B液60％；14min，B液100％；21min，B液100％；22min，B液50％；23min，B液0％；30min，B液0％。流速為10mL/min，檢測波長為254nm。

步驟3：四種純品2',3'-環形核苷單磷酸產量檢測

(1)將購買的4種2′,3′-環形核苷單磷酸標準品用蒸餾水稀釋到如下濃度梯度：0μM、20μM、40μM、60μM、80μM和100μM，采用C18反向色譜柱進行高效液相色譜檢測各濃度的環形核苷單磷酸標準品所對應的峰面積，之后以峰面積為橫坐標，濃度為縱坐標繪制標準曲線。

(2)利用做好的標準曲線，將制備好的4種2′,3′-環形核苷單磷酸樣品用C18反向色譜柱進行高效液相色譜分別檢測濃度可得，每升培養液可提取1.30±0.17μmol的2',3'-cCMP、1.40±0.12μmol的2',3'-cUMP、2.81±0.25μmol的2',3'-cGMP和2.61±0.19μmol的腺苷-2',3'-環磷酸。根據4種2′,3′-環形核苷單磷酸的分子量，將上述摩爾量換算成質量計算可得，每升培養液可提取約2.5mg的四種純品2',3'-環形核苷單磷酸。

主要參考資料

[1] CN201610430027.3 一種海洋細菌基因LfliZ及應用