64-73-3 / 去甲金霉素的制備

背景及概述^[1][2]

去甲金霉素，主要用于米諾環素和替加環素的生產。其抗菌性較強，抗菌譜與金霉素相似，其作用比四環素、土霉素強，比金霉素穩定，當前生物醫藥領域中重要的原料產品，但當前在進行去甲金霉素生產過程中，由于國外對我國長期的技術封鎖，從而導致我國去甲金霉素產品生產工作相對滯后，缺乏高效可靠，且成本低廉的去甲金霉素產品生產工藝。

而在去甲金霉素產品生產環節中，去甲金霉素菌株培育及篩選是確保去甲金霉素產品生產效率質量的重要基礎，而當前在進行對去甲金霉素菌株培育和篩選作業時，所采用的方法和工藝往往均為借鑒同類或相似菌種培育及篩選方法開展，雖然一定程度可以滿足去甲金霉素菌株培育及篩選的需要，但工作效率低下，成本相對較高，易產生大量的污染性廢棄物，且菌株培育質量穩定性和篩選精度均相對較差，嚴重影響了甲金霉素產品的產量和質量。

理化性質^[1]

去甲金霉素，別名地美環素、去甲基氯四環素等，是由金色鏈霉菌發酵產生的四環素類抗生素，用于原料藥其抗菌譜與金霉素相似，抗菌效果比四環素強，比金霉素穩定。隨著衍生物米諾環素和替加環素相繼上市和其他衍生物的持續開發，去甲金霉素的市場前景越來越廣闊。

傳統的去甲金霉素發酵生產提取方法是將去甲金霉素發酵液進行預處理、板框后濾、濾液使用醋酸丁酯和丁醇進行萃取，然后使用鹽酸反萃取濃縮再結晶、烘干得到去甲金霉素鹽酸鹽，傳統工藝使用大量的醋酸丁酯和丁醇，且二溶劑均具有很高的水溶性，故而三廢排放嚴重，環境處理成本大增；且由于發酵液的復雜性和有機溶劑萃取局限性，造成萃取困難，產品質量和收率均受到不同影響。

制備^[2]

一種高效去甲金霉素菌株培育及篩選方法：

第一步，配置培養母液，首先根據使用需要，在培養釜中配置去甲金霉素菌株培養母液，然后在10分鐘內，將去甲金霉素菌株培養母液勻速升溫至25℃并保溫，然后對去甲金霉素菌株培養母液進行30分鐘超聲波乳化作業，并在完成超聲波乳化作業后對去甲金霉素菌株培養母液保溫靜置10分鐘，然后將配制好的培養母液分為三部分，并分別承載在三個相互獨立的反應釜中，同時在其中一部分培養母液中添加生物標記物，然后超聲波混合3分鐘，制備得到生物標記液；

第二步，菌種接種，首先在無菌環境避光條件下，對培養皿和過承載架進行輻照滅活處理，然后通過菌種接種裝置將去甲金霉素菌種均與涂布在若干培養皿上表面，讓后將各培養皿通過承載架沿豎直方向進行交錯固定，且各培養皿上表面均與水平面平行分布，即可完成菌種接種；

第三步，菌種培育，將完成接種后的培養皿和承載架一同浸入到第一步中分離開的其中一部分培養母液中，并使培養皿和承載架上端面低于培養母液液面5毫米，然后在25℃恒溫環境下培育2天，即可得到將去甲金霉素菌株；且培育過程中，3小時/次的頻率對培養母液進行超聲波攪拌，且超聲波攪拌頻率為0.2MHz，每次超聲波振蕩時間為20分鐘；

第四步，熒光標記，完成第三步作業后，將培養釜中用于浸泡培養皿和承載架的培養母液排空，并選擇各培養皿中的其中一個為標的培養皿，然后將第一步配置的培養母液中的另一部分培養母液噴淋到標的培養皿外的各培養皿中，將生物標記液噴淋到標的培養皿中，且培養母液與生物標記液噴淋參數保持一致條件下，以5次/10小時的頻率進行均勻噴淋至標的培養皿外的各培養皿和標的培養皿中，并在25℃恒溫環境下持續培育5天，且培育過程中，培養皿上端面的培養母液液面高出培養皿上端面的將去甲金霉素菌種上端面1毫米，并在每次完成培養母液噴淋后，對各培養皿進行100r/min振蕩條件下持續勻速振蕩10分鐘，且振蕩時培養面上端面與水平面間夾角為30°；

第五步，篩選，將經過培育后第四步中標的培養皿中的去甲金霉素菌株進行生物標記物濃度檢測，并根據生物標記物濃度分布區域對標的培養皿中去甲金霉素菌株進行劃分，然后根據標的培養皿中去甲金霉素菌株進行劃分分布結構，依次對剩余各培養皿中菌株進行相同分布結構的劃分，從而即可完成不同菌株質量劃分篩選作業；

第六步，濃縮提純，根據第五步劃分篩選的結果，對除標的培養皿外的其他培養皿中的同區域內的去甲金霉素菌株進行分類收集匯合，然后將不符合標準的區域內的去甲金霉素菌株進行去除并無害化處理，對各區域內的去甲金霉素菌株的濃度機發育狀態分別進行濃縮提純，并使濃縮提純后各區域內的去甲金霉素菌株的濃度機發育狀態保持一致后進行二次匯合即可得到成品。

提取

將含有6.0g/L去甲金霉素的發酵液35升，調節溫度至5-10℃加入0.05wt％亞硫酸鈉35g，調節溫度至10℃，使用草酸調節pH＝1.5±0.2，攪拌20分鐘，使用南京久吾公司陶瓷膜過濾，陶瓷膜通量30升/小時；得濾液70升；

將濾液過122樹脂，流速2BV/h，完成后使用pH＝6.8-7.0的飲用水頂洗0.5小時，得脫色液72升；

將脫色液過截留分子量為150道爾頓的美國GE公司有機納濾膜組件，壓力1.5mpa，溫度保持5-10℃；得濃縮液4升；

將濃縮液攪拌條件下，調節溫度5-8℃，使用0.1M的氨水調節pH＝6.5±0.2，得到沉淀懸浮液，繼續攪拌30分鐘，靜置30分鐘，固液分離得去甲金霉素粗品；

將去甲金霉素粗品使用尿素復鹽法精制得去甲金霉素成品，烘干得去甲金霉素鹽酸鹽152g，總收率72.38％；成品送檢符合EP、USP標準。

主要參考資料

[1]林桂真, 葉蕊芳, 程林同, & 毛全貴. (2014). 常壓室溫等離子體誘變高產去甲金霉素金色鏈霉菌. 中國醫藥工業雜志, 45(11).

[2] 蘇玉山, 苗勇, 亓平言, 王冰, SuYu-shan, & MiaoYong等. (2000). 去甲金霉素提取新工藝研究. 中國抗生素雜志, 25(5), 341-343.

[3] 李士杭[1], 葉蕊芳[1], 呂和平[2], 毛全貴[2], & 戴維[2]. (2012). 去甲金霉素發酵培養基的優化及機制分析. 中國醫藥工業雜志, 43(11), 896-902.