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以E.coli JM109基因組為模板，分別以pQE-nlpE-F和pQE-nlpE-R、pQE-spy-F和pQE-spy-R為引物，通過高保真PCR擴增獲得2個基因片段，大小分別為711 bp和486 bp。PCR程序：95 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min，16 ℃ 30 s。
實時熒光定量PCR過程中所使用的DNA聚合酶SYBR® Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus) (2×Conc.)、高保真DNA聚合酶PrimerSTAR®以及限制性內切酶均購自大連寶生物有限公司，一步克隆連接酶Exnase Ⅱ購自南京諾唯贊生物科技有限公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小量制備試劑盒以及PCR產物純化試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司，其他材料和所用試劑為國產分析純。引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成，基因測序服務由賽音生物技術(上海)有限公司提供。LB培養基：酵母提取物0.5%，胰蛋白胨1.0%，NaCl 1.0%，1×105 Pa滅菌20 min。
DNA制備：將過夜活化后的E. coli JM109按照1% (V/V)的接種量轉接至30 mL新鮮LB液體培養基中，于37 ℃、120 r/min培養至OD600約為0.8時，向搖瓶中添加不同濃度(0.2%–0.8%，V/V)丁醇，繼續培養90 min后，吸取菌液2 mL，于5510×g室溫離心2 min，倒出上清培養基收集菌體，進行RNA的抽提。通過一步法cDNA合成(逆轉錄)試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)合成對應的cDNA。
熒光定量PCR：以上述cDNA為模板，以qPCR-rcsB-F/R、qPCR-cpxR-F/R、qPCR-baeR-F/R、qPCR-pspA-F/R、qPCR-rpoE-F/R為引物(表 1)，采用SYBR®Green Ⅰ嵌合熒光法(大連寶生物工程有限公司)，SYBR®Green Ⅰ與雙鏈DNA結合后發出熒光，通過檢測PCR反應生成雙鏈DNA與SYBR®Green Ⅰ結合發出的熒光強度，從而可以達到對目的基因進行準確定量的目的，反應體系參照試劑盒說明。
使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ兩種限制性內切酶對pQE80L載體進行雙酶切線性化，酶切條件為37 ℃酶切6–8 h。
將PCR擴增帶有同源臂的nlpE和spy基因片段與通過BamH Ⅰ和Hind Ⅲ兩種限制性內切酶雙酶切后的pQE80L載體通過一步克隆酶法連接體系(南京諾唯贊生物科技有限公司)連接，構建質粒pQE80L-nlpE和pQE80L-spy(圖 1)。一步克隆連接體系為：50–200 ng線性化pQE80L，20–200 ng插入片段，2 μL 5×CE Ⅱ Buffer，1 μL Exnase Ⅱ。連接體系置于37 ℃反應30 min，待反應完成后置于冰上冷卻5 min，通過化學轉化方法將連接產物轉入E. coli JM109感受態細胞，并涂布在含有卡那霉素的固體平板。次日通過菌落PCR初步驗證平板陽性單菌落，將驗證出的陽性轉化子測序驗證。
分別以spy-K-F/R和nlpE-K-F/R為引物，以質粒pKD13為模板擴增帶有同源臂的FRT-Kan-FRT片段(約1450 bp)，通過電擊法將含有同源臂FRT-Kan-FRT片段轉入含有pKD46的E. coli JM109感受態中，使其整合到E. coli JM109基因組上。將驗證成功的陽性重組子按照化學轉化感受態細胞的制備方法制備成感受態細胞，并將質粒pCP20電轉入感受態細胞中，30 ℃過夜靜置培養，再通過42 ℃高溫培養10 h以消除質粒pCP20。
將過夜活化的重組菌按照1% (V/V)的接種量轉接至30 mL新鮮LB液體培養基中，于37 ℃、120 r/min培養菌體至OD600到達0.6時，添加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，于30 ℃誘導培養6 h，在4 ℃、8801×g離心10 min收集菌體。在超聲破碎儀上進行超聲破碎15 min (超聲1 s，間歇3 s，500 W)，破碎液進行SDS-PAGE分析蛋白表達狀況。
將重組菌和帶有pQE80L的E. coli JM109 (對照菌)經轉接誘導培養(0.2 mmol/L IPTG)至OD600達到為0.8時，將0.8% (V/V)正丁醇加入到細胞培養液中，30 ℃、120 r/min培養10 h。其間每隔2 h取樣通過分光光度計OD600讀數監測菌體的生長狀況。
采用細胞粘著碳烴化合物法(microbial adhesion to hydrocarbons，MATH)來測定細胞表面疏水性變化。根據重組菌耐受性測定的方法，將過夜活化后的對照菌株E. coli JM109/pQE80L和重組菌株E. coli JM109/pQE80L-nlpE、E. coli JM109/pQE80L-spy經轉接誘導培養(0.2 mmol/L IPTG) 6 h，在4 ℃、8801×g條件下離心10 min收集菌體。徹底吸取培養基，用0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)懸浮細胞，控制初始OD400值為0.8–0.9 (A0)。吸取4.8 mL菌液與0.8 mL溶劑充分混勻，室溫靜置15 min，分層后取水相樣品測定其OD400值(A1)。粘附率用公式(1)計算。
分子生物學和蛋白質表達用微生物培養基產品：