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柚皮素是一種典型的黃酮類化合物，具有多種保健功效，例如抗肥胖癥、抗糖尿病、抗高血脂、高血壓等。從植物中提取是柚皮素的重要來源，但是植物提取法受季節(jié)性影響和產(chǎn)地影響較大，而微生物法合成具有多重優(yōu)勢，例如生產(chǎn)強度高、反應條件溫和、可以利用廉價碳源等，因此微生物法合成柚皮素具有巨大潛力。
圖1 在釀酒酵母中高效合成柚皮素策略
釀酒酵母具有生物量高、生長迅速、遺傳背景清晰、改造技術成熟等優(yōu)點，可作為優(yōu)良的柚皮素生產(chǎn)宿主。在釀酒酵母中從頭合成柚皮素需要依次外源導入四個基因，分別是酪氨酸解氨酶(tyrosine ammonia lyase，TAL)，4-羥基肉桂酰輔酶A連接酶(4-hydroxycinnamoyl-CoAligase，4CL)，查爾酮合酶(chalconesynthase，CHS)和查爾酮異構(gòu)酶(chalconeisomerase，CHI)。釀酒酵母本身具有經(jīng)莽草酸途徑合成酪氨酸的能力，以酪氨酸為前體，經(jīng)過上述四個外源基因的催化合成柚皮素。但是在釀酒酵母中異源合成柚皮素，限速步驟依然未能探索清楚，這限制了在釀酒酵母中高效合成柚皮素及下游衍產(chǎn)物。
圖2 用于鑒定限速步驟的菌株基因型
本研究首先將四個外源基因整合在釀酒酵母基因組上，構(gòu)建了一株可以從頭合成柚皮素的菌株。以此菌株作為平臺，驗證在釀酒酵母合成柚皮素的限制步驟。首先在平臺菌株上整合表達莽草酸途徑的抗反饋抑制基因ARO4K229L(3-deoxy-7-phosphoheptulonatesynthase，3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶)、ARO7G141S(chorismate mutase，分支酸變位酶)、來自于大腸桿菌的莽草酸激酶ecoaroL(shikimate kinase)，通過強化莽草酸途徑鑒定出莽草酸途徑代謝通量低是合成柚皮素的第一個限速步驟。然后再分別單獨過表達四個外源基因，驗證四個外源基因?qū)﹁制に睾铣傻挠绊?，鑒定出CHS活性低是合成柚皮素的第二個限速步驟。在鑒定限速步驟后，通過添加不同的前體確定對第一個限速步驟的解除程度，驗證了直接添加對香豆酸可以最大程度解除第一個限速步驟。然后從水飛薊中分離鑒定了一個高酶活的SmCHS，并過表達，以此解除第二個限速步驟。經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化，可以在5-L發(fā)酵罐水平積累648.63 mg/L的柚皮素。
圖3 不同菌株的柚皮素積累量
研究工作得到了國家重點研究發(fā)展計劃（2017YFC1600403），國家優(yōu)秀青年科學基金（21822806），國家自然科學基金（31670095、31770097）等項目的資助，以“Efficientbiosynthesis of (2S)-naringenin from p-coumaric acid in Saccharomycescerevisiae”發(fā)表在期刊Journal of Agricultural and Food Chemistry上（Gao et al., J. Agric. Food Chem. 2020, 68, 1015−1021）。博士生高松為論文第一作者，陳堅教授和周景文教授為通訊作者。
圖4 最佳菌株在5-L發(fā)酵罐水平發(fā)酵優(yōu)化
