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5-羧基熒光素是一種化學物質，分子式是C21H12O7。
5-羧基熒光素用于制備一種真菌熒光染色液：隨著醫療檢驗水平的不斷推進，近年來真菌熒光染色臨床檢驗技術逐漸推廣，目前市場上大多采用細胞壁β-多糖、幾丁質等熒光染色法，該方法只通過熒光染料與細胞壁 β-多糖、幾丁質等以親和力結合，不具有特異性；隨著臨床逐漸推廣發現，易受到染色底物雜質的干擾，影響觀察結果的判斷；另外，熒光衰退較快，樣本無法保存；這給臨床推廣及應用造成非常大的困擾。
針對醫學臨床檢驗中病原菌生物學檢驗，為能夠快速準確的檢驗致病真菌，CN201710899393.8提供一種真菌熒光染色液以5-羧基熒光素與真菌引物ITS4結合形成熒光引物，與真菌核糖體核糖核酸基因間隔(ITS)區堿基發生特異性的結合將真菌標記熒光，用熒光顯微鏡 在480nm波長下鏡檢觀察背景為黑色，真菌發射出520nm波長的綠色熒光。CN201710899393.8提供一種真菌熒光染色液，由以下重量份(％)的原料組成：
制備方法包括以下步驟：
1)用電子天平準確稱取5-羧基熒光素、真菌引物ITS4、水于500ml三角燒瓶中，用 玻璃棒輕輕攪拌充分溶解后，再稱取氫氧化鉀倒入燒瓶中，輕輕攪拌充分溶解后蓋上塞子；
2)將上述溶液放置于37℃恒溫搖床，緩慢振搖1小時取出，此為溶液1；
3)用電子天平準確稱取甘油、雙磷脂酰甘油、抗壞血酸、水于1L三角燒瓶中，用玻 璃棒攪拌充分溶解，此為溶液2；
4)將溶液1緩慢倒入溶液2中，邊倒入邊攪拌使其充分混合后，即得本發明真菌熒 光染色液，置于棕色瓶中保存。
本發明是這樣實現的，通過將上述原料按重量份配制成熒光染色液，熒光染色液 中5-羧基熒光素的羧基與真菌核糖體核糖核酸間隔區引物4(ITS4)的核苷酸鏈兩端的磷酸 基團端氨基殘基共價結合標記成熒光引物，在游離狀態時該熒光引物形成莖環結構避免5- 羧基熒光素衰退，在氫氧化鉀溶液中快速進入真菌細胞與真菌核糖體核糖核酸基因間隔區 (ITS)堿基發生特異性的結合，此時，莖環結構打開，露出5-羧基熒光素將真菌細胞標記熒 光，另外，甘油、雙磷脂酰甘油、抗壞血酸形成的抗熒光衰退保護層將露出5-羧基熒光素封 閉式包裹阻止熒光衰退，使真菌樣本能長期保存，用熒光顯微鏡在480nm波長下鏡檢觀察背 景為黑色，真菌發射出520nm波長的綠色熒光。與現有技術相比，
本發明的有益效果是：本發明通過加入5-羧基熒光素和真菌引物ITS4，在游離的狀態下真菌引物ITS4形 成莖環結構可有效避免熒光衰退，在氫氧化鉀溶液中5-羧基熒光素可穿透真菌細胞壁及細 胞膜與真菌核糖體核糖核酸(rRNA)基因間隔(ITS)區堿基發生特異性的結合，此時莖環結 構打開在熒光顯微鏡下鏡檢呈現熒光；氫氧化鉀在染色過程中熔化真菌角質層使真菌引物 ITS4快速進入真菌細胞內作用；另外，由于配方中加入了抗熒光衰退劑(甘油、雙磷脂酰甘油、抗壞血酸)，使熒光引物與真菌核糖體核糖核酸(rRNA)基因間隔(ITS)區堿基特異性結 合后能長期保持，同時也增加了目標真菌在鏡檢時發出的熒光強度，使目標真菌標本與背 景之間的對比度大大增強，在鏡檢過程中使目標真菌更加顯目。
因此，本發明的優點在于使用操作簡便、觀察清晰度高、特異性好、結果準確，有較好的臨床應用前景；在臨床檢驗過程 中操作簡便、效率高、使用范圍全面、特異性好、準確度高；檢驗靈敏度高，減少檢驗結果假陰性的發生，進而降低漏檢率；視野清晰，反應為熒光反應，在檢驗視野中以清晰的熒光呈現，便于觀察查找，大大提高工作效率；抗干擾能 力強，反應為特異性結合，雜質和非真菌細胞不會被熒光標記，消除了雜質和非真菌細胞對 檢驗過程中的干擾，使目標更加顯目易觀察；熒光保持時間長，加入了抗熒光衰減劑形成保護層對5-羧基熒光素進行封閉式包裹，使熒光染料不與外界接觸，從而很好的保護了熒光 染料，使熒光持久不衰減，使標本可以保存至相關規定保存期限。圖1為實施例1制得的真菌熒光染色液染色結果圖。
[1] CN201710899393.8 一種真菌熒光染色液及其制備方法