872728-81-9 / 甲磺酸達(dá)比加群酯的制備方法和有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)

背景及概述^[1]

甲磺酸達(dá)比加群酯是應(yīng)用于臨床的直接凝血酶抑制劑，是一種新型口服抗凝藥。其作用機(jī)理是通過(guò)可逆性強(qiáng)效競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合凝血酶的纖維蛋白特異結(jié)合位點(diǎn)，使纖維蛋白生成受阻，從而抑制血栓的形成。甲磺酸達(dá)比加群酯是達(dá)比加群的前體藥物，在體內(nèi)代謝后轉(zhuǎn)化為具有活性的達(dá)比加群。與華法林相比，甲磺酸達(dá)比加群酯在治療過(guò)程中無(wú)需頻繁監(jiān)測(cè)凝血功能和調(diào)整給藥劑量，藥物之間相互作用少，不受進(jìn)食影響，從而提高了患者的用藥依從性。

有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)^[1]

強(qiáng)文舟等人參考國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局達(dá)比加群酯膠囊進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于有關(guān)物質(zhì)的規(guī)定，并結(jié)合收斂型原料藥合成工藝，共獲得9個(gè)已知雜質(zhì)（A~I，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1），其中雜質(zhì)A、B、C和D為合成工藝雜質(zhì)，其余為降解雜質(zhì)。建立了甲磺酸達(dá)比加群酯原料藥中有關(guān)物質(zhì)HPLC檢測(cè)法，本方法適用性好試驗(yàn)效率高，通過(guò)驗(yàn)證表明此方法專屬性強(qiáng)且靈敏度高，能對(duì)甲磺酸達(dá)比加群酯中有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行有效控制。

1儀器、樣品與試劑

1.1儀器

島津公司LC-2010AHT高效液相色譜儀，SPDM20A二極管陣列檢測(cè)器，LabSolution色譜工作站；百萬(wàn)分之一天平（賽多利斯公司）。

1.2樣品與試劑

甲磺酸達(dá)比加群酯原料藥（批號(hào)140301、140302、140303）、甲磺酸達(dá)比加群酯對(duì)照品（純度≥99.5%，批號(hào)140204），西安新通藥物研究有限公司；對(duì)照品雜質(zhì)A（純度≥98%，批號(hào)14011202）、雜質(zhì)B（純度≥98%，批號(hào)14011902），上海百誼生物科技有限公司；對(duì)照品雜質(zhì)C、雜質(zhì)D為合成工藝中間體，純度均≥98%，西安新通藥物研究有限公司；對(duì)照品雜質(zhì)E（純度≥99.5%，批號(hào)D01833）、雜質(zhì)F（純度≥99.5%，批號(hào)D01835）、雜質(zhì)G（純度≥99.5%，批號(hào)01836）、雜質(zhì)H（純度≥99.5%，批號(hào)D01837）、雜質(zhì)I（純度≥99.5%，批號(hào)D01834），深圳菲斯生物科技有限公司；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

采用菲羅門(mén)PhenomenexC18（250mm×4.6mm，5µm）色譜柱，以pH4.5的醋酸銨緩沖液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（程序見(jiàn)表1），流速1.0mL·min^-1，柱溫為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為242nm（檢測(cè)雜質(zhì)B、D、G）、310nm（檢測(cè)雜質(zhì)A、E、F、I）、340nm（檢測(cè)雜質(zhì)C、H），進(jìn)樣量10µL。

2.2系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取雜質(zhì)A~I的對(duì)照品各5mg，精密稱定，分別置25mL量瓶中，加30%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得各雜質(zhì)的儲(chǔ)備液。取甲磺酸達(dá)比加群酯原料藥10mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加30%乙腈約5mL溶解，再分別精密加入各雜質(zhì)的儲(chǔ)備液100µL，加30%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得雜質(zhì)定位混合溶液；進(jìn)樣10µL，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。雜質(zhì)A~I各峰之間的分離度均大于1.5，達(dá)比加群酯與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度大于1.5。

2.3線性關(guān)系考察

分別取各雜質(zhì)儲(chǔ)備液及甲磺酸達(dá)比加群酯對(duì)照品適量，加30%乙腈配制成1mL中含雜質(zhì)A、B、C、D各1μg的混合溶液1，分別進(jìn)樣6、8、10、12、15μL；1mL中含雜質(zhì)E、F、G、H各2μg的混合溶液2，分別進(jìn)樣3、10、15、20、30、40μL；1mL中含雜質(zhì)I、達(dá)比加群酯各4μg的混合溶液3，分別進(jìn)樣1、3、10、15、30、50、80μL。以進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。同時(shí)計(jì)算各雜質(zhì)相對(duì)于達(dá)比加群酯的校正因子。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4檢測(cè)下限和定量下限

稱取雜質(zhì)A~I及甲磺酸達(dá)比加群酯的對(duì)照品適量，分別加30%乙腈配制成1mg·mL-1的儲(chǔ)備液，并稀釋制成系列濃度溶液，取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以信噪比S/N≥3時(shí)的測(cè)定結(jié)果作為檢測(cè)限，信噪比S/N≥10時(shí)的測(cè)定結(jié)果作為定量限見(jiàn)表2。

2.5溶液穩(wěn)定性

取甲磺酸達(dá)比加群酯原料藥10mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加30%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。該溶液在室溫（25℃）下和4~8℃分別放置，并于0、3、6、12h分別進(jìn)樣測(cè)定，分別記錄242、310、340nm波長(zhǎng)下的色譜圖。按照面積歸一化法計(jì)算含量。除了雜質(zhì)A~I按確定的檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，未知雜質(zhì)（以達(dá)比加群為參比，相對(duì)保留時(shí)間為1.16）選擇242、310、340nm3個(gè)波長(zhǎng)中吸收最強(qiáng)的波長(zhǎng)310nm計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，供試品溶液在室溫時(shí)，雜質(zhì)E和雜質(zhì)I增長(zhǎng)明顯，6h時(shí)已經(jīng)增長(zhǎng)翻倍，12h不再測(cè)定；在4~8℃時(shí)，12h內(nèi)比較穩(wěn)定。其他已知雜質(zhì)均未檢出。

2.6專屬性試驗(yàn)

2.6.1空白溶劑取溶劑（30%乙腈）10µL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果顯示溶劑對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.6.2強(qiáng)制降解取甲磺酸達(dá)比加群酯原料藥10mg，分別進(jìn)行強(qiáng)酸降解（1mol·L^-1鹽酸1mL，室溫放置4h）、強(qiáng)堿降解（1mol·L^-1氫氧化鈉1mL，室溫振搖0.5h）、氧化降解（3%雙氧水，室溫放置4h）、光照降解（4500lx日光燈光，照射24h）、高溫降解（沸水加熱1h），酸、堿降解必須進(jìn)行中和，即得各降解樣品。各降解樣品用30%乙腈制成1mg·mL^-1的降解樣品溶液，同時(shí)制備相同濃度的未破壞樣品的供試品溶液。取上述各溶液10µL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖3。在酸、堿降解條件下，主要降解得到雜質(zhì)H，并且有一相對(duì)保留時(shí)間（以達(dá)比加群酯作參比）為0.9的主要降解雜質(zhì)；在氧化、光照和高溫降解條件下，均會(huì)降解得到雜質(zhì)E；在光照和高溫降解條件下，主要降解得到雜質(zhì)E和雜質(zhì)I。

2.7精密度和回收率試驗(yàn)

取甲磺酸達(dá)比加群酯原料藥10mg，加30%乙腈5mL溶解，加入各雜質(zhì)儲(chǔ)備液適量，用30%乙腈稀釋制成每1mL含雜質(zhì)A~I及甲磺酸達(dá)比加群酯均約1μg的混合溶液，控溫4~8℃。取上述混合溶液10μL連續(xù)進(jìn)6次，記錄色譜圖。在選定的波長(zhǎng)下測(cè)定各雜質(zhì)，以各雜質(zhì)的峰面積計(jì)算精密度試驗(yàn)的RSD。結(jié)果峰面積的RSD在0.19%~0.67%，滿足精密度要求RSD≤2.0%，表明此方法精密度良好。精密稱取甲磺酸達(dá)比加群酯原料藥10mg，置10mL量瓶中，加5mL30%乙腈溶解，加入各雜質(zhì)儲(chǔ)備液適量，配制成各雜質(zhì)質(zhì)量濃度均分別為7.5、5和2.5μg·mL^-1（相當(dāng)于甲磺酸達(dá)比加群酯濃度的0.75%、0.5%、0.25%）的溶液各3份，作為回收率試驗(yàn)溶液，控溫4~8℃，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得雜質(zhì)A~I的回收率（n=9）分別為92.5%~94.5%［回收率平均值（n=3）分別為92.6%、94.2%、93.8%，RSD分別為0.14%、0.49%、0.53%］、93.4%~98.1%［回收率平均值（n=3）分別為95.4%、96.0%、94.7%，RSD分別為2.1%、2.5%、1.6%］、90.1%~97.2%［回收率平均值（n=3）分別為90.6%、95.9%、90.5%，RSD分別為0.64%、1.1%、0.67%］、92.8%~101.0%［回收率平均值（n=3）分別為94.5%、99.9%、99.3%，RSD分別為1.6%、1.1%、0.57%］、98.1%~100.7%［回收率品均值（n=3）分別為98.3%、100.4%、98.7%，RSD分別為0.21%、0.30%、0.21%］、99.8%~105.8%［回收率平均值（n=3）分別為100.1%、104.4%、105.6%，RSD分別為0.31%、0.37%、0.38%］、92.3%~97.5%［回收率平均值（n=3）分別為92.4%、94.4%、96.2%，RSD分別為0.14%、0.52%、1.2%］、95.9%~101.3%［回收率平均值（n=3）分別為96.5%、100.8%、98.1%，RSD分別為0.75%、0.50%、1.1%］和98.9%~103.8%［回收率平均值（n=3）分別為100.4%、102.6%、102.8%，RSD分別為1.7%、0.29%、1.6%］，RSD分別為0.89%、1.9%、3.0%、2.8%、0.99%、2.3%、1.9%、2.1%和1.6%。

2.8樣品測(cè)定

取3批甲磺酸達(dá)比加群酯原料藥，分別按“2.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液；精密量取供試品溶液1mL，置100mL量瓶中，加30%乙腈稀釋至刻度，搖勻，精密量取5mL，置10mL量瓶中，加30%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照溶液。取供試品溶液、對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。已知雜質(zhì)按照加校正因子的自身對(duì)照法來(lái)進(jìn)行計(jì)算各雜質(zhì)含量，未知雜質(zhì)按照主成分的自身對(duì)照法進(jìn)行計(jì)算（供試品中任何小于對(duì)照溶液主峰面積1/20的未知雜質(zhì)峰可忽略不計(jì)），結(jié)果見(jiàn)表4。

制備方法^[2]

甲磺酸達(dá)比加群酯的制備方法，其操作過(guò)程具體介紹如下：

（1）將3-[[[2-[[(4-脒基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基](吡啶-2-基)氨基]-丙酸乙酯對(duì)甲苯磺酸鹽、碳酸鉀加入溶解劑中混合均勻；

具體用量方面，3-[[[2-[[(4-脒基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基](吡啶-2-基)氨基]-丙酸乙酯對(duì)甲苯磺酸鹽用量為40g，碳酸鉀用量為56g；

混合操作時(shí)，所述溶解劑為丙酮-水體系；所述丙酮-水體系，具體由1000ml丙酮和550ml水混合均勻配制而成溶液。

所述3-[[[2-[[(4-脒基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基](吡啶-2-基)氨基]-丙酸乙酯對(duì)甲苯磺酸鹽，通過(guò)如下步驟制備獲得：

A、將3-[[[2-[[(4-氰基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-基]羰基]吡啶-2-基氨基]丙酸乙酯、甲醇加入反應(yīng)釜中；

具體用量方面，甲醇加入量為300g，3-[[[2-[[(4-氰基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-基]羰基]吡啶-2-基氨基]丙酸乙酯用量為50g，即，甲醇加入量為3-[[[2-[[(4-氰基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-基]羰基]吡啶-2-基氨基]丙酸乙酯質(zhì)量的6倍；

B、通入氯化氫氣體至飽和，室溫反應(yīng)24小時(shí)；

C、減壓蒸干后加入甲醇300g溶解，通入氨氣至飽和，室溫反應(yīng)24h；

D、然后加入對(duì)甲苯磺酸，攪拌析晶，過(guò)濾、洗滌（采用丙酮進(jìn)行洗滌）、干燥，即得3-[[[2-[[(4-脒基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基](吡啶-2-基)氨基]-丙酸乙酯對(duì)甲苯磺酸鹽；

具體用量方面，對(duì)甲苯磺酸用量為31g；

最終制得3-[[[2-[[(4-脒基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基](吡啶-2-基)氨基]-丙酸乙酯對(duì)甲苯磺酸鹽42.0g。

（2）向步驟（1）中混合均勻的反應(yīng)體系中加入氯甲酸正己酯，常溫下（20℃左右）反應(yīng)3h左右；然后4℃左右進(jìn)行析晶，過(guò)濾得粗品；

對(duì)應(yīng)步驟（1）中的用量，氯甲酸正己酯用量為11g。

（3）將步驟（2）所得粗品加精制溶劑乙醇300ml 于60℃左右溶解，溶解完全后，將反應(yīng)液降溫至4℃左右進(jìn)行析晶，過(guò)濾，得達(dá)比加群酯25.0g。

（4）將步驟（3）所得達(dá)比加群酯20.0g加反應(yīng)溶劑丙酮200ml 于42℃左右溶解，溶解完全后滴加甲磺酸3.2g，充分反應(yīng)后將反應(yīng)液降溫至4℃左右析晶，過(guò)濾，將濾餅干燥7～8h，所得即為甲磺酸達(dá)比加群酯，共獲得21.4g。

進(jìn)一步對(duì)所獲得成品進(jìn)行檢測(cè)，最終計(jì)算及檢測(cè)結(jié)果表明：以3-[[[2-[[(4-脒基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基](吡啶-2-基)氨基]-丙酸乙酯對(duì)甲苯磺酸鹽計(jì)，重量收率為 66.9%；而高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定純度為：99.8%，最大單雜0.08%。

參考文獻(xiàn)

[1]強(qiáng)文舟,張艷俠,傅強(qiáng).HPLC法測(cè)定甲磺酸達(dá)比加群酯的有關(guān)物質(zhì)[J].藥物分析雜志,2020,40(04):672-680.

[2] [中國(guó)發(fā)明] CN201810729075.1 一種甲磺酸達(dá)比加群酯的制備方法