手機掃碼訪問本站
微信咨詢
堿性磷酸酶(ALP)是成熟成骨細胞的標志性酶，同時成骨細胞形成的鈣結(jié)節(jié)也是成骨細胞的標記物。
1 Gomori鈣鈷法
2偶氮偶聯(lián)法
3堿性磷酸酶染色試劑盒法。
4.PNPP偶氮法
5.BCIP/NBT比色法
6茜素紅法
7. von Kossa法
【染色原理】
ALP在pH值9.4的環(huán)境下，以鎂離子作為激活劑，能夠把β-甘油磷酸鈉水解出磷酸，磷酸與高濃度的鈣鹽結(jié)合形成無色的磷酸鈣，再與硝酸鈷作用形成磷酸鈷，經(jīng)硫化胺處理形成黑色的硫化鈷沉淀在酶活性處。
【孵育液配制】
3%β-甘油磷酸鈉5ml
2%巴比妥鈉5ml
蒸餾水10ml
2% CaCl2 10ml
2% MgSO4 1ml
步驟
（1）將無菌的玻片放入培養(yǎng)皿中，傳代時加入適量的細胞懸液，作細胞爬片，待細胞長滿玻片后取出。
（2）PBS沖洗后用冷丙醇固定10min，蒸餾水沖洗數(shù)次。
（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自來水沖洗數(shù)次。
（4）2%硝酸鈷中浸3-5min，蒸餾水洗數(shù)次。
（5）1%的硫化銨中2min，自來水沖洗，自然干燥，封固。
結(jié)果
胞質(zhì)中陽性反應(yīng)呈現(xiàn)灰黑色顆粒或塊狀沉淀。
【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸鹽20mg
DMSO 0.5ml
0.2mol/L巴比妥醋酸緩沖液（PH 9.2）50ml
六偶氮副品紅0.5ml
1mol/L NaOH調(diào)PH 9-10，混合后過濾使用。
（六偶氮副品紅：副品紅400mg，濃鹽酸2ml，雙蒸水8ml混合過濾；臨用前與等體積4%亞硝酸鈉混合）
【步驟】
（1）細胞爬片成功后，PBS沖洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。
（2）蒸餾水沖洗。
（3）將過濾孵液直接滴加于玻片上，室溫下作用45min。
（4）流水沖洗，晾干。
（5）甘油明膠封固。
【結(jié)果】成骨細胞胞質(zhì)中可見紅色ALP陽性顆粒。
【作用原理】細胞內(nèi)堿性磷酸酶在Ph9.4-9.6條件下水解磷酸萘酚AS-MX產(chǎn)生萘酚，后者被重氮鹽捕獲，生成不溶性有色沉淀。
【步驟】
（1）用吸管吸掉96孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS沖洗3遍，加入含25mmol/L二乙醇胺，1mmol/L氯化鎂和6.7mmol/L PNPP的反應(yīng)液。
（2）每孔150ul.37℃避光放置半小時,然后加0.1mol/L氫氧化鈉100ul終止反應(yīng),用酶標儀于405nm波長下測定OD值.
（3）樣品OD值在ALP標準曲線上讀取酶活性值(U/L).
ALP標準曲線繪制:
取PNP0.0111克用三蒸水溶解后稀釋至250ml,此時PNP的濃度為320umol/L.依次稀釋到160umol/L，80umol/L,40umol/L,20umol/L,10umol/L和5mol/L.相當于ALP1280 U/L,640U/L,320U/L,160U/L,80U/L,40U/L和20U/L(活性值).用酶標儀于405nm波長下測定PNP的OD值.以ALP活性值作為自變量,對應(yīng)的OD值作為應(yīng)變量,求得直線回歸方程.
【結(jié)果】測定堿性磷酸酶的含量
BCIP/NBT（四唑硝基藍）是堿性磷酸酶底物,產(chǎn)物為深藍色,在堿性磷酸酯酶的催化下，BCIP被水解,水解產(chǎn)物與NBT發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性的深藍色至藍紫色的NBT-formazan。
【步驟】
1.在膜或組織切片，最后一次洗滌完畢后，加入適量BCIP/NBT染色工作液
2.室溫避光孵育5-30分鐘或更長時間(可長達24小時)，直至顯色至預(yù)期深度.
3.用蒸餾水洗滌1-2次即可終止顯色反應(yīng)
4.膜標本可干燥后避光保存；組織切片或細胞樣品，顯色反應(yīng)終止后，可以用中性紅復(fù)染染色
【結(jié)果】有不溶性的深藍色物質(zhì)出現(xiàn)
針對鈣沉積物“鈣結(jié)節(jié)”的染色方法
【步驟】
（1）培養(yǎng)皿用PBS沖洗2次，95%乙醇固定10min，雙蒸水沖洗3次。
（2）0.1%茜素紅-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，30min。
（3）蒸餾水沖洗，干燥，封片。
【結(jié)果】染料品種的不同，礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)不同的紅色。
【步驟】
（1）培養(yǎng)皿用PBS沖洗2次，4％多聚甲醛固定5分鐘，雙蒸水沖洗3次。
（2）培養(yǎng)皿中加入5％硝酸銀溶液1ml，將培養(yǎng)板開蓋在紫外燈下照射1小時。
（3）倒出殘留的硝酸銀溶液，蒸餾水沖洗3遍。
（4）培養(yǎng)皿中加入5％硫代硫酸鈉溶液1ml，中和殘留的硝酸銀溶液，吸出殘液。
（5）室溫下晾干，封固。
【結(jié)果】鈣結(jié)節(jié)呈現(xiàn)清晰可見的黑顏色。