9001-99-4 / 核糖核酸酶A的提取方法

背景及概述^[1]

核糖核酸酶A是一類水解RNA的酶，廣泛存在于所有動植物和微生物中，按其作用位點和磷酸酯鍵斷裂的方式可分為生成3′-磷酸基團(tuán)的內(nèi)切核糖核酸酶(膜核糖核酸酶、核糖核酸酶T1和生成5′-磷酸基團(tuán)的內(nèi)切核酸酶(RNase H)、外切核糖核酸酶(大腸桿菌RNaseⅡ、大腸桿菌的寡核苷酸RNase、RNA的腫瘤病毒的RNase H)。核糖核酸酶，核糖核酸酶T1是實驗室中除去樣品中的RNA或RNA順序測定中常用的酶。胰核糖核酸酶(RNase A)是從牛胰中提取的RNase，是高度專一的內(nèi)切核酸酶，專一水解RNA鏈中的嘧啶核苷酸鍵，生成3′-嘧啶核苷酸或3′末端為嘧啶核苷酸的寡核苷酸，核糖核酸酶T1是從米曲霉菌中制備的一種高度專一性的內(nèi)切核酸酶，專一水解RNA產(chǎn)生3′鳥苷酸和3′端為鳥苷酸的寡核酸。核糖核酸酶H(RNase H)常用于反轉(zhuǎn)錄合成中，只作用于DNA-RNA雙鏈中的RNA。

提取方法^[2]

一種核糖核酸酶A的提取方法，分離提純具有酶活性的、高純度的S核糖核酸酶，可用于分離提純其它薔薇科果樹(如蘋果、杏、梅、櫻桃等)雌 蕊S基因的S核糖核酸酶和其它植物組織特異性蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的一種核糖核酸酶提取方法，包含下列步驟：

1)植物樣品的采集：采集開花前的大花蕾，從花蕾分解出花柱，經(jīng)稱重后裝入塑 料瓶內(nèi)，保存于液氮中待用；

2)抽提液的制備(配方)：以MES/NaOH緩沖液(pH＝6.5)為制備抽提液的溶液， 按溶液體積比添加3％的polyclar-AT、1.5％抗壞血酸鈉和5mmol·L^-1的EDTA·Na2， 得到核糖核酸酶抽提液A；

3)抽提過程：

在1～4℃低溫條件下，取花柱樣品，加入上述核糖核酸酶抽提液A進(jìn)行提取后，離心，上清液為花柱可溶性蛋白質(zhì)溶液，經(jīng)過孔經(jīng)0.45μm的過濾網(wǎng)過濾后，以流速 0.5～1ml/min的速率通過CM瓊脂糖凝膠(CM sepharose)陽離子交換層析柱之后，用 100～200ml的20mmol·L^-1 MES/NaOH緩沖液清洗上述CM層析柱，而后用100～200ml 的350mmol·L^-1NaCl溶液將核糖核酸酶從CM層析柱中洗脫下來，獲得核糖核酸酶 溶液B；

按體積比添加4倍液的20mmol·L^-1MES/NaOH緩沖液稀釋，同樣經(jīng)孔徑0.45μm 的過濾網(wǎng)過濾后，將其以流速0.5～1ml/min的速率通過SP瓊脂糖凝膠(SP sepharose) 陽離子交換層析柱；用100～200ml的180mmol·L^-1NaCl溶液以相同的流速來清洗上述SP層析柱；再用100～200ml的250～320mmol·L^-1的NaCl溶液將吸附于SP層析柱內(nèi)的核糖核酸酶全部溶出，回收得到核糖核酸酶溶液C；

核糖核酸酶溶液C用按溶液體積計算100％飽和的硫酸銨沉析后離心，獲得核糖 核酸酶。

相關(guān)研究^[3-4]

王立霞等人為了了解核糖核酸酶ARnaseⅢrncS基因缺失對單核細(xì)胞增生李斯特菌(LM)環(huán)境應(yīng)激和生物被膜形成的影響，以LMSB5強毒株為對象，利用溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKSV7，通過基因重疊延伸PCR(SOE-PCR)和同源重組技術(shù)構(gòu)建LM-ΔrncS基因缺失突變株，檢測其在不同溫度、pH、高鹽、乙醇、H₂O₂脅迫環(huán)境下的適應(yīng)能力，通過結(jié)晶紫染色法檢測生物被膜的形成能力。

結(jié)果：與LM-SB5株相比，構(gòu)建的LM-ΔrncS在37℃、pH 4及pH 7的環(huán)境適應(yīng)能力無顯著變化(P>0.05)，而在30℃、42℃、pH 9、5%NaCl、3.8%乙醇、0.1%H₂O₂的應(yīng)激環(huán)境下其適應(yīng)能力及生物被膜的形成能力顯著降低(P<0.05)，提示RnaseⅢRncS參與了LM對低溫、高溫、堿、高鹽、乙醇及H₂O₂脅迫環(huán)境的適應(yīng)過程及生物被膜形成的調(diào)控。結(jié)論：構(gòu)建的LM-ΔrncS基因缺失突變株，在不同應(yīng)激環(huán)境下的適應(yīng)能力及生物被膜形成能力均顯著降低，為RnaseⅢRncS參與LM ncRNA調(diào)控環(huán)境應(yīng)激的分子機制研究奠定了基礎(chǔ)。

楊科成等人利用分子動力學(xué)模擬研究了在不同尿素濃度下，核糖核酸酶Sa(RNase Sa)表面水和尿素分子的分布和動力學(xué)行為。結(jié)果表明，尿素分子可與RNase Sa酶形成較強的相互作用，并取代其表面的水分子而富集在蛋白質(zhì)表面。尿素分子更傾向與RNase Sa酶的疏水殘基作用，與RNase Sa酶主鏈形成氫鍵的能力更強。尿素分子的平動和轉(zhuǎn)動遠(yuǎn)遠(yuǎn)慢于水分子的平動和轉(zhuǎn)動。RNase Sa酶表面水分子的平動和轉(zhuǎn)動隨著尿素濃度增加而逐漸變慢，但RNase Sa酶表面尿素分子的動力學(xué)并不依賴于尿素濃度變化。本研究中明晰的RNase Sa酶表面水和尿素分子分布和動力學(xué)有助于理解水和尿素分子對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。

主要參考資料

[1] 衛(wèi)生學(xué)大辭典

[2] CN02137955.6 一種核糖核酸酶A的提取方法

[3] 王立霞，孟慶玲，喬軍，蔡擴(kuò)軍，王登峰，伍曄暉，王熙鳳，郭晶，才學(xué)鵬.核糖核酸酶ARnaseⅢ rncS基因缺失對單核細(xì)胞增生李斯特菌環(huán)境應(yīng)激的調(diào)控作用研究[J].中國病原生物學(xué)雜志，2018，13(10):1078-1083.

[4]楊科成，崔鳳超，李云琦.核糖核酸酶Sa表面水和尿素分子的分布和動力學(xué)行為的分子動力學(xué)模擬[J].應(yīng)用化學(xué)，2018，35(10):1243-1248.