9003-98-9 / DNA酶的應用

背景及概述^[1]

DNA酶是水解DNA的一類核酸酶，包括內切酶 (DNase I和限制性內切酶)與外切酶(外切酶Ⅲ、Ⅶ)。DNA酶廣泛存在于多種哺乳動物、蝦類、昆蟲和植物中，對于個體的發育、細胞正常的老化凋亡、以及防御系統的構建具有重要的生物學功能。DNA酶是一種多功能核酸內切酶,可以以非特異性的方式切割DNA,作用于兩個脫氧核糖核苷酸之間的3',5'-磷酸二酯鍵，將DNA鏈切割開并將其降解成單個核苷酸或寡聚核苷酸。其中研究最多的是哺乳動物和人類的DNA酶，例如來源于牛胰腺的DNase I被廣泛應用于生物學研究和醫學分子檢測試劑盒，而來源于人的重組DNaseI還被應用于一些疾病的治療，例如囊腫性纖維化(cystic fibrosis,CF)、肺不張和復雜性肺炎伴胸腔積液和膿胸等。

制備^[3]

近些年來的研究發現，DNA酶也是昆蟲防御系統的重要組成部分，例如對黃蜂毒液 的主要成分進行分析，發現包括組胺、五羥色胺、蛋白酶、緩激肽、DNA酶和透明質酸酶等。相 對于人和哺乳動物的DNA酶，昆蟲的DNA酶相關的研究相對較少，對它們的活性研究以及應用實例也處在相對缺乏的狀態。

CN201810526954.4公開了一種全新的短管赤眼蜂DNA酶，將編碼短管赤眼蜂全新DNA酶的基因 序列進行密碼子優化以后，合成并導入畢赤氏酵母表達系統中，通過發酵條件的優化，實現 了新DNA酶的高效表達，體外DNA降解實驗表明，短管赤眼蜂DNA酶能有效降解雙鏈DNA，其活 性與來源于牛胰腺的DNase I相當，并且其活性高度依賴于二價鎂離子(Mg2+)，加入高于鎂 離子濃度的螯合劑EDTA后可有效抑制其酶活，具體方案如下：所述短管赤眼蜂DNA酶的氨基酸序列和編碼該氨基酸序列的核苷酸序列分別為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。本發明第二個方面公開了一種生產上述的短管赤眼蜂DNA酶的方法，包括以下步驟：

S1:將短管赤眼蜂基因LOC111693613(Genbank accession number: LOC111693613)進行密碼子優化；

S2：將S1得到的核苷酸序列克隆到重組質粒進行基因擴增；

S3：將S2得到的基因片段導入表達載體得到重組表達載體；

S4：將S3中得到的重組表達載體轉化入畢赤氏酵母的感受態細胞中；

S5：將S4中轉化成功的感受態細胞進行篩選，得到高產量表達短管赤眼蜂DNA酶的 畢赤氏酵母菌株Pichia-TPDNase；

S6：將S5中得到的畢赤氏酵母菌株Pichia-TPDNase進行大規模培養，分離純化發 酵液得到短管赤眼蜂DNA酶。

應用^[4]

人體內的鉀是維持細胞生理活動的主要陽離子，是保持機體的正常滲透壓及酸堿平衡，參與糖及蛋白質代謝，保證神經肌肉的正常功能所必需，其含量是人 體生理活動的重要指標。尿液、血清中鉀離子的含量水平在臨床上可用了診斷一 些腎臟、心臟等方面的疾病。

CN201510031940.1提供一種基于DNA酶檢測鉀離子濃度的方法。包括下述：

(1)配制標準溶液DNA酶體系

用含鈉離子的緩沖液溶解可溶性鉀鹽配置多個濃度梯度的鉀離子溶液，分別向每個濃度梯度的鉀離子溶液中加入DNA，得到多個DNA含量相同的鉀離子-DNA體系；所述多個DNA含量相同的鉀離子-DNA體系反應后，得到多個構象不同的DNA G-四 鏈體的體系，分別向各個所述DNA G-四鏈體的體系中加入氯化血紅素，得到氯化血 紅素含量相同的多個DNA G-四鏈體-氯化血紅素體系，所述多個DNA G-四鏈體-氯化 血紅素體系反應后，得到多個標準溶液DNA酶體系；所述DNA為能夠形成G-四鏈體的DNA；

(2)配制待測溶液DNA酶體系

將待測樣品加入到所述含鈉離子的緩沖液，得到待測樣品溶液，向所述待測樣品 溶液中加入所述DNA，得到待測樣品-DNA體系，所述待測樣品-DNA體系中所述DNA 的含量與所述多個DNA含量相同的鉀離子-DNA體系中所述DNA的含量相同；所述 待測樣品-DNA體系反應后，得到DNA G-四鏈體的體系，向該體系中加入氯化血紅素， 反應后，得到DNA G-四鏈體-氯化血紅素體系，所述DNA G-四鏈體-氯化血紅素體系 中的氯化血紅素含量與所述多個DNA G-四鏈體-氯化血紅素體系中的氯化血紅素含量 相同；所述DNA G-四鏈體-氯化血紅素體系反應后，得到待測溶液DNA酶體系；

(3)標準溶液及待測溶液的配制

將2,2′-聯氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽ABTS溶液與H₂O₂混合，得到混合液，將該混合液稱為底物溶液，向所述多個標準溶液DNA酶體系中的每一個標 準溶液DNA酶體系中加入所述底物溶液進行反應，得到多個標準溶液樣本；向所述待測溶液DNA酶體系中加入所述底物溶液進行反應，得到待測溶液樣本；

(4)標準曲線的制備

測量所述多個標準溶液樣本在420nm處的吸光度，繪制鉀離子濃度與吸光強度值的標準曲線；

(5)待測樣本檢測

測量所述待測溶液樣本在420nm處的吸光度，根據所述標準曲線，得到所述待測樣品中鉀離子的濃度。

主要參考資料

[1] 獸醫大辭典

[2] CN201680012991.2 修飾的DNA酶及其用途

[3] CN201810526954.4 一種短管赤眼蜂DNA酶及其生產方法和應用

[4] CN201510031940.1 一種基于DNA酶檢測鉀離子濃度的方法