手機掃碼訪問本站
微信咨詢
血紅蛋白是血紅細胞中的最主要蛋白成分，同時也是血液的主要蛋白成分，在紅細胞中還含有微量的超氧化物歧化酶(S0D)、碳酸酐酶、糖酵解酶系等，在血漿部分則含有200多種功能不同的蛋白組分，有的屬多酶系統(tǒng)如補體系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)和激肽原系統(tǒng)等，有的屬免疫球蛋白類、蛋白酶抑制物、轉(zhuǎn)輸?shù)鞍最?、類脂蛋白類等?/p>
S1、血液的選?。菏紫葟尼t(yī)院或醫(yī)療機構(gòu)收取過期人血，然后通過稱量設(shè)備量取所需體積的過期人血，備用；
S2、血漿的去除：將步驟S1量取的過期人血倒入離心設(shè)備中，然后以轉(zhuǎn)速為450r/min，溫度為28℃的條件下旋轉(zhuǎn)離心15min，之后沉淀35min，即可完成將過期人血中的紅細胞分離出來，然后采用緩沖液系統(tǒng)將分離出來的紅細胞洗滌2次，洗滌液常用等紅細胞體積的等滲溶液如生理鹽水，該洗滌過程也同時除去來白細胞和血小板，能夠去除血漿蛋白和部分膜磷脂，緩沖液系統(tǒng)為125mM的NaCl、13mM的葡萄糖、2.5mM的MgCl2、54mM的KH2PO4和19mM的K2HPO4組成的緩沖溶液，使用該緩沖液系統(tǒng)進行洗滌，能夠防止紅細胞的破裂和維持穩(wěn)定的胞內(nèi)環(huán)境；
S3、血紅蛋白的釋放：經(jīng)過步驟S2得到堆積的血紅細胞后，先把紅細胞置于腎透析儀中，再倒入低滲溶液中透析1.5h，使紅細胞逐斷膨脹以至膜破裂，然后再將透析后的混合溶液轉(zhuǎn)移至0,lμm的超濾制備中，從而過濾出血紅蛋白溶液，其中基本上不含有任何脂類，通過低滲溶液來溶脹紅細胞，使部分膜孔打開以釋放血紅蛋白，最大限度地釋放血紅蛋白而又較完整地保存了細胞膜的結(jié)構(gòu)，低滲溶液為2.5mM的MgCh、6mM的K2HPO4和2.4mM的KH2PO4組成的混合溶液，腎透析儀選自型號為BC2600的全自動血細胞透析儀；
S4、基質(zhì)的除去：將步驟S3得到的血紅蛋白溶液轉(zhuǎn)移至離心設(shè)備內(nèi)，在25000g的離心力下，離心時間為80min，除去紅細胞膜及膜碎片基質(zhì)，然后分類上清液，將所得的上清液依次過0.45和0.2pm濾膜以進一步除去更小的基質(zhì)和病菌，之后使用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH和鹽離子濃度，所得的上清液是含有微量雜蛋白和脂類的血紅蛋白溶液，pH調(diào)節(jié)劑為1mol/L的碳酸鈉溶液；
S5、血紅蛋白的純化：用100kd的濾膜或病毒濾器過濾，以起到脫磷脂或病毒的作用，再通過凝膠排阻層析柱對血紅蛋白溶液進行分離，即可得到血紅蛋白純品，血紅蛋白的純化可除去99.7％以上的磷脂和99,9％以上的血型抗原，凝膠排阻層析柱為WatersQMA-Acell柱，該層析柱一次能夠得到21g血紅蛋白，且需時僅為1h。
取新鮮抗凝牛血，用0.9％NaCl洗滌血液三次，用冷水溶解紅細胞。在4℃條件下，離心30分鐘，去除細胞碎片和未溶解的細胞，上清液即為待純化的血紅蛋白溶液；向待純化的血紅蛋白溶液中加入填充劑Na2SO4，按100ml待純血紅蛋白溶液加入2.85g填充劑Na2SO4，得到待純化血紅蛋白樣品；上樣前，用平衡液0.2M Na2SO4/25mM Tris-HCl平衡親和層析色譜的介質(zhì)，親和層析所用介質(zhì)為CM Sephadex-Sulfanilamide，然后將制備好的待純化血紅蛋白樣品上樣，直至與介質(zhì)層面齊平,得到流穿液，即為純化的血紅蛋白。
整個過程在2～6℃條件下進行：
1、將加入了抗凝劑如肝素的豬動脈血離心去除血漿、白細胞、血小板，用生理鹽水洗滌紅細胞2～4次，低速離心后得到壓積紅細胞；
2、用2～8倍壓積紅細胞體積的低滲溶液如0.01M NaCl或低滲PBS溶解壓積紅細胞，通入氮氣或氬氣等惰性氣體，在溶血液中加入pH值為7.0～7.4的維生素C至溶液pH值達到7.0～7.4，再加入保護劑如葡萄糖至終濃度為1～5％，加入青霉素和鏈霉素等常規(guī)抑菌藥物，充分攪拌1～4小時，高速離心10～30分鐘后得到粗制血紅蛋白溶液；
3、往粗制血紅蛋白溶液中加入體積是粗制血紅蛋白溶液1/10～1/4的甲苯，震蕩搖勻后低溫條件下萃取2～6小時，取下層血紅蛋白溶液進行透析；
4、將血紅蛋白溶液裝入透析袋中，在加有抗氧化保護和抑菌藥物的透析液中透析36～72小時，中間更換1～3次透析液，去除殘留甲苯和小分子物質(zhì)；
5、將透析后的血紅蛋白溶液加入適量保護劑冷凍真空干燥成干粉后，溶解成高濃度、小體積的液體，上樣于葡聚糖凝膠層析柱純化，收取分子量均一的高純度血紅蛋白；
6、經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌去熱原，然后冷凍干燥成高純度無基質(zhì)無熱源的血紅蛋白干粉保存于2～8℃。
高密度發(fā)酵技術(shù)一直是工業(yè)生產(chǎn)中要求的高效技術(shù)。對于很多需氧微生物，在發(fā)酵過程中限制細胞密度的最為重要的因素是氧氣的利用。因此需要開發(fā)出了多種針對提高需氧微生物氧氣利用率的技術(shù)。
CN201510845454.3提供了一種利用血紅蛋白提高發(fā)酵細胞密度的方法。本發(fā)明提供了一種提高微生物發(fā)酵細胞密度的方法，通過在細胞周質(zhì)空間表達血紅蛋白和/或細胞表面展示(surfacedisplay)血紅蛋白，和/或重塑細胞外膜的方法，促進血紅蛋白與氧氣的接觸，從而提高氧氣的利用效率，實現(xiàn)提高微生物發(fā)酵密度。實驗證明，本發(fā)明構(gòu)建的工程菌可以提高微生物發(fā)酵細胞密度以及胞內(nèi)積累產(chǎn)物PHB的含量。