9008-02-0/血紅蛋白的檢測方法

概述^[1]

血紅蛋白，作為一種血液替代物，具有滲透活性和運輸和傳遞氧的能力，但它具有通過腎路線和經(jīng)過血管壁的循環(huán)中迅速消除的缺點，導(dǎo)致一種很短的，因此，典型地不令人滿意的半衰期。進(jìn)一步地，人血紅蛋白也常常被有毒水平的內(nèi)毒素、細(xì)菌或病毒污染。

天然血紅蛋白通常在紅細(xì)胞內(nèi)主要起攜氧釋氧作用，供給機(jī)體氧氣的需要。血紅蛋白分子量為64.5KD，內(nèi)含四個亞基，兩個α亞基，兩個β亞基。Hb中每個亞基由肽鏈和一個血紅素(heme)分子組成，每個heme分子上有一個二價鐵。含二價鐵的血紅蛋白稱為亞鐵血紅蛋白，具有攜氧釋氧作用；其中結(jié)合氧的亞鐵血紅蛋白稱為氧合血紅蛋白(O2Hb)，未結(jié)合氧的亞鐵血紅蛋白稱為脫氧血紅蛋白(HHb)。亞鐵血紅蛋白容易被轉(zhuǎn)變成其他形式的血紅蛋白，如被氧化后形成高鐵血紅蛋白(metHb)(二價鐵被氧化成三價鐵的血紅蛋白)、與CO結(jié)合形成碳氧血紅蛋白(COHb)、與硫化物結(jié)合形成硫化血紅蛋白(SHb)等等。未強(qiáng)調(diào)是哪種血紅蛋白類型的，通常都是指氧合血紅蛋白。

血紅蛋白氧載體主要目的是克服血紅蛋白本身的腎毒性，代替紅細(xì)胞攜氧釋氧的功能。目前主要應(yīng)用于急性失血病人的緊急救治或是在紅細(xì)胞不可獲得的情況下代替紅細(xì)胞使用，使用劑量都較大，需要通過靜脈給藥。

血紅蛋白滅活病毒^[2]

步驟1：在一可密閉容器中加入10mg/mL的豬血紅蛋白80mL，再加入10ml豬偽狂犬病毒（PRV），攪拌，在溶液上方通入氮氣，再將蛋白溶液用氣體交換膜進(jìn)行脫氧處理，液相一側(cè)接溶液，氣相一側(cè)通入氮氣，將亞鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化成脫氧血紅蛋白，待轉(zhuǎn)化率大于95%并且溶液中的氧分壓低于2mmHg時進(jìn)行步驟2；

步驟2：加入10mL10%連二亞硫酸鈉，使其終濃度達(dá)到1%，反應(yīng)1.5h，去除殘余的氧；

步驟3：逐滴加入0.5mol/L鹽酸，使溶液pH逐漸降低至4.0左右，停止通入氮氣，密封容器，阻止容器內(nèi)部與大氣交換；

步驟4：在15℃條件下，攪拌21天；

步驟5：逐滴加入0.5mol/L氫氧化鈉，使溶液pH升至7.5，打開容器；

步驟6：以氯化鈉為透析液，充分透析上述溶液，收集得到的蛋白溶液即為滅活病毒后的蛋白溶液。

檢測方法^[3]

血紅蛋白的檢測方法包括：硫酸銅滴定法進(jìn)行血紅蛋白測定，或者采用進(jìn)口大型生化分析儀進(jìn)行測定。前者存在自行配制誤差大、易受環(huán)境溫度影響等缺點,后者儀器價格昂貴,測試成本高。國外常用的測試方法為試劑盒和干式生化分析法,試劑盒法需要大型生化分析儀,干式生化分析法產(chǎn)品主要有德國的Re-flotronⅣ型全血干式生化分析儀和瑞典的SWELAB血液分析儀,采用的均是波長比色法,所需采血量較大,測試時間長,成本高。

免疫層析膠體金技術(shù)的優(yōu)點是微創(chuàng)取樣，取樣量少，成本低，檢測快，準(zhǔn)確度高，適用于現(xiàn)場及家庭檢測，而目前市場上未出現(xiàn)免疫層析技術(shù)檢測血紅蛋白含量的產(chǎn)品，其技術(shù)難點在于血紅蛋白雙抗體夾心存在HOOK效應(yīng)，因此目前免疫層析雙抗體技術(shù)還是主要集中在潛血，隱血的檢測項目中。

Hook效應(yīng)是指在雙位點夾心免疫試驗中，其劑量反應(yīng)曲線的高劑量區(qū)段，線性走向不是呈平臺狀無限后延，而是向下彎曲狀，此現(xiàn)象稱之為HOOK效應(yīng)。目前對于血紅蛋白的免疫學(xué)檢測，一般需要多步稀釋才能使其處于線性范圍內(nèi)，但這樣造成的誤差勢必會加大。

主要參考資料

[1]周翔海, & 紀(jì)立農(nóng). (2005). 空腹血糖和糖化血紅蛋白用于篩查糖尿病的研究. 中國糖尿病雜志, 13(3), 203-205.

[2] 黃應(yīng)平, 蔡汝秀, HuangYingping, & CAIRuXiu. (2001). 血紅蛋白作為過氧化物模擬酶催化顯色體系的研究與應(yīng)用. 分析化學(xué), 49(4), 378-382.

[3] 王全林, 劉志洪, 蔡汝秀, & 呂功煊. (2003). 血紅蛋白的過氧化物酶催化特性研究. 化學(xué)學(xué)報, 61(1), 34-39.