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即T4DNA連接酶。DNA連接酶（EC6.5.1.1）用于體外DNA連接、連接檢測PCR，體內岡崎片斷連接成完整基因組DNA有重要作用。基因工程所用DNA連接酶由公司提供，最常用的是T4DNA連接酶（T4Lig）。
T4 DNA連接酶由T4嗜菌體30基因合成，最早從T4嗜菌體感染的E。coli提取。后來發現DNA復制缺失型嗜菌體中連接酶產量更高，從而作為連接酶的主要來源，目前市場供應連接酶通過基因工程方法生產。Murry測定T4 DNA連接酶分子量為63000~68000Da，Armstrong進一步確定為55，230Da，由487個氨基酸（Aa）殘基組成，基因長度1464bp（GenBank序列號為X00039）。按照分子量與分子大小比例關系估算，T4 DNA連接酶大小約3。4nm，可跨越約1個DNA雙螺旋長度（即10bp）。連接酶占據連接端口下游（5’-P端部）7~10bp，占據端口上游（3’-OH端部）3~5bp。只有487Aa的酶分子同時具有連接活性，拓撲異構活性表明其結構、功能比較復雜。與之相比，E.coliDNA連接酶671Aa，分子量74000Da，每個E.coli細胞含有約300個DNA連接酶分子，與DNA聚合酶分子個數接近，可以滿足DNA復制時岡崎片斷連接需要，細菌和真核生物中岡崎片斷長度分別為1000bp左右和100~200bp。
相對于DNA聚合酶，連接酶保真性不太熟悉，特別是DNA體外連接的科研人員。連接酶保真性是指酶分子識別連接端口核苷酸的能力。T4 DNA連接酶識別連接端口堿基能力較低，從而連接多種異常端口：3’或5’無嘌呤或無嘧啶堿基、缺失1nt的連接端口、3’和5’A-A或T-T配對、5’G-T配對、3’C-A、C-T、T-G、T-T、T-C、A-C、G-G、G-T配對。連接反應中加入亞精胺（spermidine）、高鹽緩沖液，或降低連接酶用量可以提高T4 DNA連接酶保真性。Wu等發現100nMDNA在1UT4 DNA連接酶，200mM高鹽濃度下保真性可提高60倍。隨著保真性提高，Km增加4倍，Vmax降低~30倍。釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）DNA連接酶保真性較高，可識別1nt缺失端口和3’A-G或T-G配對端口，但是識別5’A-C、T-C、C-A、G-A匹配能力不高。5’-P端部核苷酸識別能力較低可能與5’-P-AMP復合物的形成有關。與常溫作用的T4 DNA連接酶連接酶（37℃）不同，有些高溫作用的DNA連接酶：Pyrococcusfuriosus（Pfu）連接酶、Thermusaquaticus（Taq）連接酶、Thermusthermophilus（Tth）連接酶、Thermotogamaritima（Tma）連接酶。TaqDNA連接酶反應溫度45~65℃，TmaDNA連接酶反應溫度60℃。TaqDNA連接酶保真性比T4 DNA連接酶、E.coliDNA連接酶高很多。TthDNA連接酶保真性比T4 DNA連接酶高24倍。TthDNA連接酶具有3’-5’外切活性，可以切去與模板非匹配堿基。TthDNA連接酶的保真性較高，可能與TthDNA聚合酶3’-5’外切活性較低有關，高溫菌T.thermophilusDNA合成中很少摻入錯配堿基，需要TthDNA連接酶切去岡崎片斷連接時錯配堿基。TthDNA連接酶中K294R和K294P突變后，既保留了該酶的切口DNA連接活性，又提高了保真性約4倍和11倍。T4 DNA連接酶識別錯配堿基能力較低，可能與T4 DNA連接酶的3’-5’外切活性有關。
目前DNA連接反應機理是基于切口雙鏈DNA底物得到的：普遍認為連接反應由三步完成：①T4 DNA連接酶先由ATP供能產生E-AMP復合物；②E-AMP復合物識別雙鏈DNA切口位置，將AMP轉移到5’-P基團，形成5’-P-AMP復合物；③3’-OH親核攻擊5’-P-AMP形成磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。在PDB數據庫（October2015Release）檢測不到T4 DNA連接酶的晶體結構，導致連接機理不完全明了，特別是平端DNA連接機理不完善。以熱穩定性PfuDNA連接酶晶體結構為模板，筆者通過同源分子建模模擬T4 DNA連接酶結構（圖1）。顯示出DNA連接酶有三個保守性結構域：DNA結合結構域DBD（DNA-bindingdomain，M1~L129），腺苷酰化結構域AdD（adenylaitiondomain，I130~E368），寡核苷酸鏈結合結構域OBD（oligonucleotide-binding-fold，V369~E482）。腺苷酰化結構域AdD中K159是腺苷酰化位點，通過該位點形成N6-AMP-lysine酶-底物復合物。根據相似性比對發現，R164、R182、R359、K365是ATP結合位點，E217、E344二價金屬離子結合位點（UniProtKB登錄號：P00970）。Rossi等切除T4 DNA連接酶N-端80個Aa、C-端57個Aa、C-端137個Aa分別得到NΔ80、C-Δ57、C-Δ137突變體，酶學性質表明N端80個Aa、C端57個Aa在DNA結合中起重要作用。模擬結構顯示N端M1~L129是DBD結構域，C端V369~E482是OBD結構域（圖1），均與DNA結合有關。端部切除顯示E-DNA復合物有兩種狀態：腺苷酰化酶分子復合物的短暫態（T·complex）：是指ATP將AMP轉移到連接酶K159上形成E-AMP復合物；去腺苷酰化態酶分子復合物的穩定態（S·complex）：是指E-AMP復合物將AMP轉移到連接端口5’-P基團形成5’-P-AMP復合物，需要尋找附近的3-OH，所以此時E-DNA復合物是一種穩定態，穩定態復合物與平端連接有關。K159是T4 DNA連接酶酶分子腺苷酰化作用位點，K159L突變體表明K159不參與識別DNA、但是K159L突變后酶分子不能完成自身腺苷酰化。在AMP存在下，K159L突變體具有DNA內切活性，可以將超螺旋質粒DNA切成環狀切口DNA，解除DNA超螺旋。
Sgaramella檢測到T4 DNA連接酶具有平端連接功能。T4 DNA連接酶以切口雙鏈DNA為底物時動力學參數顯示Kcat=0.4s-1，Kcat/Km=1.5×108M-1s-1，以粘性末端、平端DNA為底物時Km值分別為0。6μM、50μM，表明T4 DNA連接酶對切口比平端端口DNA親合力高5個數量級，所以平端DNA連接時需要高出10倍的酶量。在T4RNA連接酶存在時，T4 DNA連接酶連接平端DNA效率接近于粘性末端DNA。T4 DNA連接酶連接平端DNA效率很低，加入高濃度血清白蛋白、聚乙二醇（PEG：polyethyleneglycol）、Ficoll0、高氯化鈷能提高平端連接效率。PEG存在時，大鼠肝細胞核連接酶和E。coli連接酶也能連接平端DNA，發現加入32%PEG200后E.coli連接酶具有平端連接功能。PEG存在時，提高溫度有利于分子連接。粘性末端需要堿基間互補匹配的氫鍵作用，16℃過夜連接更有效。平末端不需要氫鍵作用，在20℃較高溫度下容易形成磷酸二酯鍵。DNA濃度高于0.3nM容易形成分子間連接、主要用于基因克隆。DNA濃度低于0.3nM時容易形成分子內連接，主要用于質粒DNA分子自身環化，DNA分子內平端連接可以高效構建重組質粒。目前分子內連接主要用于突變研究，如Quickchange、TaKaRaMutanBESTKit突變、原位易錯PCR一步構建突變體文庫等。因為平端連接效率很低，為了將平端轉換為粘性末端，在DNA端部引入限制性酶切位點，通過酶切后產生粘性匹配末端以提高連接效率。為了避免限制性酶切效率的限制，通過T載體、PEASY-載體、拓撲異構酶連接載體等粘性連接載體，進一步，開發了無限制性酶切的PCR方法連接載體，利用噬菌體同源重組酶的同源基因克隆方式，Gibson連接方式是利用T5外切酶產生粘性匹配末端，由PhusionDNA聚合酶將缺口補齊，而后由TaqDNA連接酶連接端口。
DNA連接需要三個步驟完成，ATP將AMP轉移到酶分子K159上，而后E-AMP復合物識別DNA雙鏈切口位置，將AMP轉移到端口5’-P形成5’-P-AMP復合物，在酶分子作用下由3-OH親核攻擊形成磷酸二酯鍵。通過下列幾種方式檢測連接端口是否形成二酯鍵。1）限制性內切酶檢測：經限制性酶切的質粒DNA經4Lig連接后，能夠用相同的限制性酶切開，說明T4 DNA連接酶將平端DNA連接成雙鏈。2）堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）抗性檢測：堿性磷酸酶能夠從線性DNA端部降解核苷酸，酶連產物如果能抗堿性磷酸酶消化，則表明單個DNA分子連接成多聚物。電泳可以檢測DNA單體是否形成了多聚體，但是只能檢測是否存在多聚體，不能證明是否形成磷酸二酯鍵。3）堿變性檢測：經高溫變性或堿變性后，重新恢復到非變性環境，不同構型的DNA分子有不同表型。環狀DNA能保持環狀形態，但是線性（或環狀切口）DNA則會在堿變性后成為“bushes”［18］。筆者電泳檢測發現堿變性后線性DNA分子還是處于變性前的條帶位置，可能分子量相同而構型不同。4）DNA環化后轉化率檢測：完整質粒經化學方法轉化可產生104個轉化子/ng，檢測DNA環化后能否達到此種轉化率，從而證明DNA連接后是否形成完整質粒。電泳能夠檢測DNA連接產物是否產生超螺旋條帶，但是必須≥10ng才能檢測出來。不同限制性酶切出的平端連接效率不同，Rusche發現Bsu限制性酶切割SPPI/pSC101DNA產生的DNA在15~25℃連接效率大約達到75%。但是連接產物轉化后，只達到<4%質粒轉化率，說明質粒DNA經酶切后再連接不能形成完整質粒。筆者發現平端DNA連接后轉化率約為4%，表明DNA連接形成質粒的效率不高。在超螺旋質粒DNA中加入T4 DNA連接酶，會發生RF1和RF2構型的轉換，4h后有5%質粒DNA是RF1構型，由T4 DNA連接酶拓撲異構活性產生。
硫化葉菌（Sulfolobussolfataricus）雙鏈DNA結合蛋白Sso7d具有底物結合活性，將其融合PfuDNA聚合酶，保留了DNA擴增的保真性，同時提高了聚合酶3’-5’外切活性，從而切去與模板非匹配堿基，提高了聚合酶持續合成能力。高保真的Phusion、Q5DNA聚合酶同樣融合了DNA結合結構域，從而提高了聚合酶持續合成能力。因為T4 DNA連接酶對平端DNA連接效率很低，其理性改造是融合DNA結合結構域。Wilson等為了提高T4 DNA連接酶連接酶對底物結合力，進行了Sso7d與連接酶的融合研究。融合Sso7d后，T4 DNA連接酶對平端DNA連接活性提高了60%。融合人工合成的家鼠-人類嵌合型轉錄因子cTF后，T4 DNA連接酶對平端DNA和載體連接效率提高160%。融合人類轉錄因子NF-kBp50-后，E.coliDNA連接酶的連接效率也得到明顯提高。
[1]賀添艷,劉亞娟,徐文選,劉猛,劉亮偉。T4DNA連接酶性質及其平端連接功能[J]。河南科學,2016,34(07):1058-1062。