941678-49-5/魯索利替尼的制備方法

背景及概述^[1]

魯索利替尼Ruxolitinib（又稱蘆可替尼）是一種激酶抑制劑，用于治療中間或高危骨髓纖維化,包括原發性骨髓纖維化，真性紅細胞增多癥后骨髓纖維化和原發性血小板增多癥后骨髓纖維化患者。魯索利替尼（ruxolitinib，Jakavi）是一種口服JAK1和JAK2酪氨酸激酶抑制劑，于2012年8月獲歐盟批準，用于治療中級或高危骨髓纖維化，包括原發性骨髓纖維化，真性紅細胞增多癥后骨髓纖維化和原發性血小板增多癥后骨髓纖維化。目前，魯索利替尼Jakavi已獲全球50多個國家批準，包括歐盟、加拿大和一些亞洲、拉丁美洲和南美洲國家。諾華從Incyte公司授權獲得魯索利替尼Ruxolitinib在美國以外的開發和商業化權利。歐盟委員會和FDA均已授予魯索利替尼Ruxolitinib治療骨髓纖維化的孤兒藥地位。目前，Incyte已經在美國以商品名Jakafi銷售，用于中級或高危骨髓纖維化的治療。真性紅細胞增多癥（polycythemiavera，PV）是一種慢性、無法治愈的血液癌癥，該病與血細胞生產過剩相關，導致血液增稠，血液凝塊風險增加。這些血凝塊可導致嚴重心血管并發癥，如中風和心臟病發作，從而增加病發率和死亡率。紅細胞增多癥患者，常有脾臟腫大及額外衰弱的癥狀。許多患者經常規治療后會變得不耐受或抵抗，這與病情惡化的風險升高有關。

制備^[2]

步驟1：環戊基甲醛(化合物2)的制備

稱取溴代環戊烷若干，少量溶于5倍體積無水THF中，加入鎂屑(1eq)，催化量碘單質，氮氣保護，升溫至40℃左右引發反應，控溫30～40℃滴加溴代環戊烷，滴完，保溫攪拌1～2h，控溫10℃以下滴加DMF(1.05eq)，滴完后，室溫30℃攪拌1h，向料液中加入3倍體積的MTBE，0℃以下滴加3N稀鹽酸調pH3～4，分液，水層用MTBE提取兩次(每次用3倍體積)，至產物基本提出，合并有機相，飽和鹽水洗滌兩次，無水Na₂SO₄干燥，過濾，減壓濃縮至干，得粗品環戊基甲醛，收率90％～95％，直接用于下一步反應。

步驟2：3-環戊基丙烯酸甲酯(化合物3)的制備

稱取叔丁醇鉀(1.05eq)，溶于10倍體積的無水THF中，氮氣保護，0℃左右，向料液中滴加磷酰基乙酸三甲酯(1.1eq)，滴完，保溫0℃左右，攪拌反應2～3h，稱取環戊基甲醛若干，配制成2倍體積無水THF溶液，0℃左右滴加到上述料液中，滴完后，升至室溫30℃左右攪拌反應12～15h，反應完。料液中加入5倍體積MTBE稀釋，10倍體積水，分液，水層分別用3倍體積的MTBE反萃兩次，飽和鹽水洗滌兩次，無水Na₂SO₄干燥，過濾，減壓濃縮得粗品3-環戊基丙烯酸甲酯，收率85％～90％，直接用于下一步反應。

步驟3：3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸甲酯(化合物4)的制備

稱取3-環戊基丙烯酸甲酯若干，溶于5倍體積的乙腈中，料液加入4-溴吡唑(1.1eq)，DBU(1.5eq)，加完，料液室溫30℃攪拌反應約12～16h，原料反應完全。減壓濃縮小體積，料液中加入5倍體積MTBE稀釋，水洗，1N稀鹽酸調pH3～4洗滌，水洗，飽和鹽水洗滌，無水Na₂SO₄干燥，過濾，減壓濃縮得粗品3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸甲酯，收率90～95％，直接用于下一步水解。

步驟4：3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸(化合物5)的制備

稱取3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸甲酯若干，溶于6倍體積的THF中，料液加入氫氧化鋰一水合物(1.2eq)3倍體積水溶液，加完，料液室溫30℃攪拌反應1～2h，原料反應完全。料液加入5倍體積的MTBE稀釋，料液加入1N稀鹽酸調pH3～4，分液，水層用3倍體積的MTBE反萃兩次，合并有機相，水洗滌、飽和NaCl液洗滌，無水Na₂SO₄干燥，過濾，減壓濃縮得粗品3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸，收率85％～90％，直接用于下一步拆分。

步驟5：(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸(化合物6)的制備

稱取3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸若干，溶解于5倍體積的異丙醇中，再向該料液中加入(1S,2R)-1-氨基-2-茚醇(0.9eq)的3倍體積異丙醇溶液，料液室溫攪拌12-15h，過濾固體。固體粗品用5倍體積異丙醇重結晶，料液緩慢冷卻析晶，過濾固體，固體粗品用5倍體積異丙醇重結晶，料液緩慢冷卻析晶，過濾固體，烘干檢測光學純度高于99％，化學純度高于99％，收率30～35％。

稱取上述烘干固體若干，加入4倍體積的MTBE，加入用1N稀鹽酸先調節PH至3～4左右，分液，水層用3倍體積MTBE反萃。合并有機相，水洗滌，飽和鹽水洗滌，無水Na₂SO₄干燥，過濾，減壓濃縮得粗品(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸，收率90％～95％，HPLC純度高于99％。

該步產物核磁數據如下：¹HNMR(CDCl₃,400MHz)δ:1.03～1.12(1H,m),1.16～1.27(1H,m),1.33～1.40(1H,m),1.41～1.70(4H,m),1.83～1.90(1H,m),2.33～2.44(1H,m),2.87(1H,dd,J＝16.0,4.0Hz),3.13(1H,dd,J＝16.0,12.0Hz,),4.21～4.26(1H,m),7.44(1H,s),7.48(1H,s).

步驟6：(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸(化合物6)的制備

稱取3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸若干，溶解于5倍體積的異丙醇中，再向該料液中加入S-苯乙胺(0.9eq)的3倍體積異丙醇溶液，料液室溫攪拌12-15h，過濾固體。固體粗品用5倍體積異丙醇重結晶，料液緩慢冷卻析晶，過濾固體，固體粗品用5倍體積異丙醇重結晶，料液緩慢冷卻析晶，過濾固體，烘干檢測光學純度高于99％，化學純度高于99％，收率10～15％。

稱取上述烘干固體若干，加入4倍體積的MTBE，加入用1N稀鹽酸先調節pH至3～4左右，分液，水層用3倍體積MTBE反萃。合并有機相，水洗滌，飽和鹽水洗滌，無水Na₂SO₄干燥，過濾，減壓濃縮得粗品(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸，收率90％～95％，HPLC純度高于99％。

步驟7：(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸(化合物6)的制備

稱取3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸若干，溶解于5倍體積的異丙醇中，再向該料液中加入奎寧(0.9eq)的5倍體積異丙醇溶液，料液室溫攪拌12-15h，過濾固體。固體粗品用10倍體積異丙醇重結晶，料液緩慢冷卻析晶，過濾固體，固體粗品再次用10倍體積異丙醇重結晶，過濾固體，固體粗品再次用10倍體積異丙醇重結晶，料液緩慢冷卻析晶，過濾固體，烘干檢測光學純度高于99％，化學純度高于99％，收率10～15％。

稱取上述烘干固體若干，加入4倍體積的MTBE，加入用1N稀鹽酸先調節PH至3～4左右，分液，水層用3倍體積MTBE反萃。合并有機相，水洗滌，飽和鹽水洗滌，無水Na₂SO₄干燥，過濾，減壓濃縮得粗品(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸，收率90％～95％，HPLC純度高于99％。

步驟8：(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸(化合物6)的制備

稱取3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸若干，溶解于5倍體積的異丙醇中，再向該料液中加入辛可尼丁(0.9eq)的5倍體積異丙醇溶液，料液室溫攪拌12-15h，過濾固體。固體粗品用10倍體積異丙醇重結晶，料液緩慢冷卻析晶，過濾固體，固體粗品再次用10倍體積異丙醇重結晶，過濾固體，固體粗品再次用10倍體積異丙醇重結晶，料液緩慢冷卻析晶，過濾固體，烘干檢測光學純度高于99％，化學純度高于99％，收率5～10％。

稱取上述烘干固體若干，加入4倍體積的MTBE，加入用1N稀鹽酸先調節PH至3～4左右，分液，水層用3倍體積MTBE反萃。合并有機相，水洗滌，飽和鹽水洗滌，無水Na₂SO₄干燥，過濾，減壓濃縮得粗品(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸，收率90％～95％，HPLC純度高于99％。

步驟9：(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酰胺(化合物7)的制備

稱取(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酸若干，溶于4倍體積干燥四氫呋喃中，加入羰基二咪唑(3eq)，氮氣保護，室溫反應3h，原料反應完全。料液通氨氣約30分鐘，料液加入4倍體積的MTBE稀釋，料液加入4倍體積的水分液，水層用3倍體積的MTBE反萃，合并有機相，水洗滌，飽和鹽水洗滌，無水Na₂SO₄干燥，過濾，減壓濃縮得粗品(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酰胺，10倍體積正庚烷打漿得白色固體，收率90～95％，HPLC98％以上。

所得產物核磁數據如下：¹HNMR(CDCl₃,400MHz)δ:1.03～1.13(1H,m),1.20～1.30(1H,m),1.33～1.41(1H,m),1.43～1.71(4H,m),1.79～1.87(1H,m),2.31～2.43(1H,m),2.68(1H,dd,J＝16.0,4.0Hz),2.94(1H,dd,J＝16.0,8.0Hz),4.26～4.32(1H,m),5.36(1H,brs),5.52(1H,brs),7.43(1H,s),7.74(1H,s)

步驟10：(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙腈(化合物8)的制備

稱取(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙酰胺若干，溶于4倍體積干燥四氫呋喃中，加入五氧化二磷(3eq)，氮氣保護，升溫60～70℃反應1～2h，原料反應完全。料液加入4倍體積的MTBE稀釋，料液加入4倍體積的飽和碳酸氫鈉淬滅，分液，水層用3倍體積的MTBE反萃，合并有機相，水洗滌，飽和鹽水洗滌，無水Na₂SO₄干燥，過濾，減壓濃縮得粗品(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙腈，收率90％～95％，直接用于下一步反應。

該步產物核磁數據如下：¹HNMR(CDCl₃,400MHz)δ:1.08～1.17(1H,m),1.18～1.27(1H,m),1.44～1.76(5H,m),1.87～194(1H,m),2.42～2.52(1H,m),2.86(1H,dd,J＝16.0,4.0Hz),3.02(1H,dd,J＝16.0,8.0Hz),4.08～4.14(1H,m),7.51(1H,s),7.52(1H,s).

步驟11：(R)-3-(4-硼酸-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙腈(化合物9)的制備

稱取(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙腈若干，溶于4倍體積干燥四氫呋喃中，氮氣保護，料液降溫-15℃，向料液中滴加異丙基氯化鎂(1.15eq)，加完，料液-5℃～5℃攪拌反應1h，控制溫度-5℃以下，滴加干燥的硼酸三異丙酯(1.05eq)，滴完后，-5～5℃反應1～2h，反應完全，料液加入4倍體積的MTBE稀釋，料液加入4倍體積的飽和氯化銨淬滅，分液，水層用3倍體積的MTBE反萃，合并有機相，水洗滌，飽和鹽水洗滌，無水Na₂SO₄干燥，過濾，減壓濃縮得粗品(R)-3-(4-硼酸-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙腈，10倍體積正庚烷打漿得白色固體，收率85％～90％，HPLC98％以上。

該步產物核磁數據如下：¹HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ:1.02～1.12(1H,m),1.19～1.29(2H,m),1.36～1.61(4H,m),1.72～1.80(1H,m),2.26～2.37(1H,m),3.02～3.15(2H,m),4.36～4.42(1H,m),7.73(1H,s),7.76(2H,brs),7.92(1H,s).

步驟12：6-氯-5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-(雙叔丁氧碳基)基胺(即化合物10)的制備

具體步驟如下：

(1)稱取POCl₃(4eq)加入反應瓶中，氮氣保護下，冷卻至0℃左右，向料液中加入DMF(1.85eq)，滴加時，控溫于0～8℃，加完，料液0～10℃，攪拌1h，向料液中加入4,6-二羥基嘧啶，加完，料液自然升溫至室溫，攪拌1h，然后升溫至回流，攪拌2h，料液冷卻，攪拌過夜。料液減壓蒸去多余的POCl₃，殘余物緩慢加入冰水中，用乙酸乙酯提取產物(2倍體積*3)，合并有機相，水洗(2倍體積)，飽和碳酸氫鈉溶液洗滌(2倍體積)，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，得粗品4,6-二氯嘧啶-5-羧甲醛(yield:70％)，直接用于下一步反應。

(2)稱取4,6-二氯嘧啶-5-羧甲醛若干，加入甲苯溶解(5倍體積)，向料液中加入7MNH3/MeOH溶液(3eq)，料液加熱至60℃，攪拌反應1h，補加入NH₃/MeOH溶液(1eq)，繼續攪拌1h，TLC檢測，原料基本反應完全。料液冷卻至室溫，減壓濃縮蒸出溶劑，殘余物中加入適量H2O(3倍體積)，攪拌，乙酸乙酯/正丁醇混合溶劑(V/V＝2/1)提取(4倍體積*2)，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮干，得粗品4-氨基-6-氯嘧啶-5-羧甲醛(yield：100％)，直接投入下一步反應。

(3)稱取(甲氧基甲基)三苯基-氯化膦若干(1.05eq)，加入THF(30倍體積)，攪拌，氮氣保護下，降溫至-5℃，向其中加入t-BuOK(1.05eq)，加完，料液0℃，攪拌1h。向上述料液分批加入4-氨基-6-氯嘧啶-5-羧甲醛，加完，料液自然升溫至室溫，攪拌反應30h，TLC檢測，原料基本反應完全。料液冷卻至0℃，加入飽和氯化銨液淬滅反應，料液中加入濃鹽酸，調節PH至1～2，料液用乙酸乙酯提取(2倍體積*2，萃除雜質)，水層再用6NNaOH液調節pH至8～9，用乙酸乙酯提取(10倍體積*3)，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮得6-氯-5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-基胺粗品(yield:60％)，直接用于下一步反應。

(4)稱取6-氯-5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-基胺若干，加入乙酸乙酯(15倍體積)，DMAP(0.2eq)，攪拌，向該料液中滴加入Boc₂O(2.2eq)，加完，料液升溫至45～50℃，攪拌反應2h，TLC檢測，原料基本反應完全。料液冷卻至0～5℃，1NHCl溶液洗滌(5倍體積)，飽和碳酸氫鈉液洗滌(5倍體積)，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，得6-氯-5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-(雙叔丁氧碳基)基胺粗品(E/Z＝5/1)，該粗品經乙酸乙酯/庚烷體系重結晶，得6-氯-5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-(雙叔丁氧碳基)基胺(E式)即化合物10(yield:60％)，類白色固體。

步驟13：(3R)-環戊基-3-[4-(5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-基胺)吡唑-1-基]丙腈(化合物11)的制備

稱取(R)-3-(4-硼酸-1H-吡唑-1-基)-3-環戊丙腈(1eq)、6-氯-5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-(雙叔丁氧碳基)基胺(1.03eq)、碳酸鉀(3eq)、Pd(PPh₃)₄(3％eq)若干，加入反應瓶中，向瓶中加入THF(10倍體積)和H₂O(2倍體積)，體系氮氣置換3～4次，氮氣保護下，料液加熱至50～60℃，反應12～15h，原料基本反應完全。向料液中加入乙酸乙酯(10倍體積)和H2O(5倍體積)，攪拌，靜置，分液，有機相H₂O洗滌(3倍體積)，無水硫酸鈉干燥，過濾(墊適量硅膠)，濾液減壓濃縮干，得粗品(3R)-環戊基-3-[4-(5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-基胺)吡唑-1-基]丙腈(yield：96％)，直接用于下一步反應。

步驟14：(3R)-環戊基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)吡唑-1-基]丙腈(化合物12，即魯索利替尼)的制備

稱取上步粗品(3R)-環戊基-3-[4-(5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-基胺)吡唑-1-基]丙腈若干，溶于THF溶液中(4倍體積)，向其中加入濃鹽酸(2.2eq)，料液在室溫攪拌2～3h，再升溫至回流，攪拌反應5h，TLC檢測，原料基本反應完全，料液冷卻至室溫，加入飽和NaHCO₃溶液，調節pH至8～9，加入乙酸乙酯提取(10x)，有機相經水洗滌(3倍體積)，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，得(3R)-環戊基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)吡唑-1-基]丙腈粗品(yield：90％)。

參考文獻

[1][中國發明]CN201610409408.3一種魯索利替尼制劑及其應用

[2][中國發明,中國發明授權]CN201610707767.7一種JAK抑制劑及其鹽的制備方法