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核苷及其衍生物在抗病毒和抗腫瘤方面的作用近年來(lái)越來(lái)越引起人們的關(guān)注。 1992 年 C .Perigaud 等人對(duì)核苷類抗病毒藥物進(jìn)行了綜述。2′ -脫氧鳥苷是合成寡脫氧核苷酸等多種抗病毒 、抗腫瘤核酸藥物的重要原料，在市場(chǎng)上有廣泛需求。脫氧鳥苷很難用化學(xué)合成法進(jìn)行合成，到現(xiàn)在為止仍沒(méi)有成熟的化學(xué)合成脫氧鳥苷方法的報(bào)道。
現(xiàn)在獲得脫氧鳥苷的方法主要是采用以 DNA為原料，先用核酸酶水解生成脫氧核苷酸，然后再用磷酸單酯酶水解，使其生成脫氧核苷，此方法成本高，而且 DNA 來(lái)源有限，大規(guī)模生產(chǎn)會(huì)受到限制。關(guān)于酶法合成脫氧鳥苷的報(bào)道，日本橫關(guān)鍵三等應(yīng)用肺炎克雷伯氏菌( K lebsiella pneumoni -ae) 生成脫氧鳥苷的方法，但轉(zhuǎn)化率僅為28 %。
使用產(chǎn)氣腸桿菌為酶源，以 2 ′ -脫氧尿苷和鳥苷為底物，2 ′ -脫氧鳥苷轉(zhuǎn)化率僅為 18 %。其它亦有用胸苷和 2，6-二氨基嘌呤生成 2，6-二氨基 2′ -脫氧核苷，再用腺苷脫氨酶處理得到脫氧鳥苷的方法，但工藝步驟多，成本較高。
2＇-脫氧鳥苷是一種天然的脫氧核苷，可直接用于制備組合脫氧核苷藥物或者作為化學(xué)試劑用于生化研究；同時(shí)可作為中間體用于合成一些抗病毒核苷類藥物以及分子標(biāo)記物，如以2’-脫氧鳥苷原 料合成8-溴-2’-脫氧鳥苷和8-羥基-2’-脫氧鳥苷等重要分子標(biāo)記物；合成2’-脫氧鳥苷的6位衍生物，如6-甲氧基、6-氨基等系列重要抗腫瘤的2’-脫氧鳥 苷衍生物。
另外采用2’-脫氧鳥苷為原料合成致癌或抗癌過(guò)程中的重要分子標(biāo)記物N7-鳥嘌呤烷化物，該方法是以2′-脫氧鳥苷為原料，以碘乙烷、環(huán)氧乙烷、1-溴-2-氯乙烷、3-溴丙烯或1，2-二溴乙烷作為烷化劑，在二甲基亞砜、冰醋酸或二甲基乙酰胺溶液中，于15~50℃，反應(yīng)0.5~96h，反應(yīng)完畢后進(jìn)行減壓蒸餾，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析分離純化，用乙酸乙酯∶石油醚(體積比)=10~20∶1和乙酸乙酯∶無(wú)水甲醇(體積比)=10~20∶1洗脫液分別洗脫，得到N7-鳥嘌呤烷化物。方法具有反應(yīng)條件溫和、分離純化過(guò)程簡(jiǎn)單、產(chǎn)物收率高、對(duì)環(huán)境污染較少等優(yōu)點(diǎn)，有利于N7-鳥嘌呤烷化物的大量生產(chǎn)。
方法1：利用產(chǎn)核苷磷酸化酶的乙酰短桿菌細(xì)胞酶法合成 2′ -脫氧鳥苷，其可能的反應(yīng)機(jī)理如圖 1所示：
以脫氧胸腺嘧啶核苷( Thymidine，dTR) 為脫氧核糖的供體，鳥苷酸(GM P) 為堿基鳥嘌呤的供體，在核苷磷酸化酶的作用下合成脫氧鳥苷。該實(shí)驗(yàn)還優(yōu)化了其酶反應(yīng)條件，從而得到 56.4 %的胸苷轉(zhuǎn)化率，并使用離子交換法分離得到了純度90.2 %的脫氧鳥苷。它具有步驟簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間較短，產(chǎn)物分離比較容易等優(yōu)點(diǎn)。具體步驟如下：
1）乙酰短桿菌的培養(yǎng)和濕菌體制備：在1 L的帶擋板的錐形瓶中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基 200 mL，于 121 ℃滅菌 20 min，冷卻后從新鮮、長(zhǎng)勢(shì)良好的乙酰短桿菌斜面上接種，36 ℃培養(yǎng) 16 h，然后將培養(yǎng)液 10 000 r/min 離心 10 min，棄去上清液，所得菌體用 30 mm ol/ L 磷酸鹽緩沖液( pH 7.0)洗滌2 ～ 3次，作為酶源冷凍備用。
2）脫氧鳥苷酶法合成及工藝優(yōu)化：20mmol/L 的脫氧胸腺嘧啶核苷( dTR)，20 mm ol/ L的鳥苷酸 (GMP )，5 % 的濕菌體，100 m L30 mmol/L pH 6.98 磷酸鹽緩沖液作為標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物，在60 ℃的恒溫水浴槽中攪拌反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為 6h。在不改變其它條件的情況下，依次考察不同的反應(yīng)溫度、菌體量、反應(yīng) pH、磷酸鹽緩沖液濃度、底物濃度、底物比率和反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶反應(yīng)的影響，優(yōu)化其反應(yīng)條件。
3）酶反應(yīng)液中脫氧鳥苷的分離純化：取適量的脫氧鳥苷反應(yīng)液，高溫滅活后用硅藻土過(guò)濾，在其中加入 5 mmol/L 的四硼酸鈉，再通過(guò) pH 中性的氯型陰離子樹脂進(jìn)行分離，以 0.5 倍柱體積每小時(shí)的流速上樣洗脫，上樣結(jié)束后用 0 ～ 0.2 mol/L的 NaCl 進(jìn)行梯度洗脫，分布收集洗脫液。取收集到的脫氧鳥苷洗脫液脫鹽濃縮結(jié)晶，得到脫氧鳥苷樣品。
方法2：一種核苷類藥物中間體2’-脫氧鳥苷的生產(chǎn)方法，是采用產(chǎn)脫氧核苷核糖轉(zhuǎn)移酶 的發(fā)酵乳桿菌CGMCC 1.1880菌體漿狀物為生物催化劑，在聚乙二醇（PEG）/無(wú)機(jī)鹽雙水相轉(zhuǎn)化體系，以β-胸苷和鳥嘌呤為原料進(jìn)行酶促反應(yīng)，最后獲得2’-脫氧鳥苷。所述的雙水相轉(zhuǎn)化體系中所用多聚物為聚乙二醇，所選的種類有PEG4000、 PEG8000、PEG10000、PEG15000和PEG20000。其優(yōu)選為PEG10000和PEG15000，其最優(yōu)選為 PEG10000。
所述聚乙二醇的濃度為25g/L-55g/L，包括 25g/L、45g/L和55g/L，優(yōu)選 PEG10000的的濃度為45g/L。雙水相轉(zhuǎn)化體系中所用無(wú)機(jī)鹽為磷酸鹽，所選的鹽種類有磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉和磷酸二氫銨，優(yōu)選為磷酸二氫鉀。磷酸鹽的濃度為30g/L-60g/L，包括30g/L、 45g/L和60g/L，優(yōu)選磷酸二氫鉀的濃度為45g/L。底物為β-胸苷和鳥嘌呤，其中β-胸苷濃度為16.5g/L，鳥嘌呤所選的濃度為10.3g/L-18.0g/L，包括10.3g/L、15.2g/L和18.0g/L，優(yōu)選濃度為15.2g/L；β-胸苷和鳥嘌呤摩爾比為1：1-2，包括1：1、1：1.5和1：2，優(yōu)選的比例為1：1.5。
β-胸苷是目前五種脫氧核苷（2’-脫氧腺苷、2’-脫氧尿苷、2’-脫氧胞苷、2’-脫氧 鳥苷和β-胸苷）中最易得、價(jià)廉的脫氧糖基供體，而鳥嘌呤相比于其它含鳥嘌呤結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，如鳥苷、鳥苷酸或者2，6-二氨基嘌呤等，是最為直接、易得和價(jià)廉的脫氧核糖受體，因此，采用生物催化法制備2’-脫氧鳥苷，鳥嘌呤和β-胸苷作為初始底物是最理想的組合。
方法3：一種用乙酰短桿菌的核苷磷酸化酶合成2’-脫氧鳥苷的方法，包括如下步驟：
(1)將乙酰短桿菌(Brevibacteriumacetylicum)QD96-CGMCCNo.0472接入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)獲得的菌體作為核苷酸磷酸化酶?jìng)溆茫凰雠囵B(yǎng)基為常規(guī)的，其組分和重量含量包括：牛肉膏1％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl0.5％，pH為7.0；
(2)然后將步驟(1)獲得的菌體加入底物溶液，所述底物溶液中，脫氧核糖受體的含量為5～40mol/L，脫氧核糖供體濃度為5～40mol/L，磷酸緩沖液濃度為10～50mmol/L，菌體的濕重加入重量為1～5％，40～65℃反應(yīng)1～4h，離心，獲得溶液含有2’-脫氧鳥苷的溶液，溶液經(jīng)HPLC檢測(cè)，2’-脫氧鳥苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)60％，然后從反應(yīng)產(chǎn)物中收集2’-脫氧鳥苷；所述的脫氧核糖受體選自鳥嘌呤、鳥苷或鳥苷酸，但由于鳥嘌呤在水中溶解度較低，其中以鳥苷酸為最佳；所述的脫氧核糖供體選自2’-脫氧核糖、2’-脫氧核糖-1-磷酸，胸苷、2’-脫氧尿苷或2’-脫氧胞苷等，但從目前原料來(lái)源難易和價(jià)格因素考慮，選擇胸苷、2’-脫氧尿苷或脫氧核糖較好。
[1] 李喻, 竇潔, 曹靜, 邱蔚然, & 周長(zhǎng)林. (2011). 乙酰短桿菌酶法合成 2′-脫氧鳥苷.藥物生物技術(shù),18(2), 119-123.
[2] CN201510140553.1一種核苷類藥物中間體2’-脫氧鳥苷的生產(chǎn)方法
[3] CN201110114010.4N7-鳥嘌呤烷化物的制備方法
[4] CN201010611733.0用乙酰短桿菌的核苷磷酸化酶合成2’-脫氧鳥苷的方法