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產(chǎn)品詳情

Paramushir病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)
1. 一站式,用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分,包括引物和對(duì)照。
2. 根據(jù)Paramushir病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物,具有良好的特異性。
3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測(cè),靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍,可以達(dá)到至少 1000 拷貝/反應(yīng)。
4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù),RT 和 PCR 兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成,不需要中間轉(zhuǎn)移樣品,降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR。
規(guī)格及成分

編號(hào)

成分

規(guī)格

試劑一

2×qRT-PCR 緩沖液

500 μL(棕色管)

試劑二

10×qRT-PCR 酶混合液

100 μL(紅蓋)

試劑三

ROX 染料 I,50×

20 μL(棕色管)

試劑四

ROX 染料 II,50×

20 μL(棕色管)

試劑五

熒光 PCR 專用模板稀釋液

1mL(黃蓋)

試劑六

Paramushir病毒染料法 qRT-PCR 引物混合液

100 μL(白蓋)

試劑七

Paramushir病毒染料法 qRT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照 (1×10E8 拷貝/μL)

50 μL(黃蓋)

試劑八

沙核酸釋放劑(試用裝)

20 次(1mL,綠蓋)

試劑九

使用手冊(cè)

1 份

運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸、-20℃保存,有效期一年。
陽(yáng)性對(duì)照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,只提供 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
自備試劑
樣品 RNA。
使用方法
一、稀釋陽(yáng)性對(duì)照:
以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例,由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
2. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(本試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
3. 換槍頭,在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備:
5. 如果有 N 個(gè)樣品,必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取,多出的一個(gè)是 PC(樣品制備陽(yáng)性對(duì)照),一個(gè)是 NC(樣品制備陰性對(duì)照)??梢杂?10μL 上步制備的陽(yáng)性對(duì)照梯度稀釋液中的第 4 號(hào)(濃度為 1×10E4 拷貝/μL,10μL 相當(dāng)于 1 萬(wàn)拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽(yáng)性對(duì)照(加水后其總體積跟樣品一樣,樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)。可以用水作為制備的陰性對(duì)照。
6. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA,本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)(20 μL 體系,在樣品制備室進(jìn)行):
7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照,6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管,其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照(用水做模板),1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照(用第 4 號(hào)陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟,定性分析只是把 6 個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個(gè),其余不變。
8. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加):

成分

N+2個(gè)制備所得樣品

qRT-PCR

陰性對(duì)照

qRT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照

(2-7 管)

2×qRT-PCR 緩沖液

10μL

10 μL

10 μL

Paramushir病毒染料法qRT-PCR 引物混合物

2 μL

2 μL

2 μL

50×ROX (見(jiàn)注)

0.4μL

0.4μL

0.4μL

樣品制備所得 RNA 模板 (來(lái)于第 8 步)

5.6μL

--

--

稀釋所得 6 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照 (來(lái)于第 6 步)

--

--

5.6μL(2 號(hào)樣到 2 號(hào) 管,3 號(hào)樣到 3 號(hào)管…)

超純水

--

5.6μL

--

10×qRT-PCR 酶混合液

2μL

2μL

2μL

注: 需使用 ROX 染料 I 的機(jī)型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的機(jī)型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX 的機(jī)型:Thermal Cycle Dice Real Time System,LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
9. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR(參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化)。

過(guò)程

溫度

時(shí)間

RT(逆轉(zhuǎn)錄)

50℃

15-30 min

預(yù)變性

95℃

5 min

Qrt-PCR反應(yīng) 40 個(gè)循環(huán)

95℃

15 sec

58℃

1 min,(采集FAM通道的熒光信號(hào))

按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行溶解曲線分析

四、數(shù)據(jù)處理:
10. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA濃度的 log 值,再推算出其濃度。
11. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),只判斷陽(yáng)性或陰性,則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),有典型擴(kuò)增曲線,Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性,如果小于 40,則為陽(yáng)性。
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