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禽類肉瘤病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

品牌:紀寧生物

貨號:JN28220

規格: 50次

聯系方式:021-54721350

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產品詳情

禽類肉瘤病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
產品及特點
1. 即開即用,用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2. 引物和探針經過優化,靈敏性高。
3. 提供陽性對照,便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高,引物是根據禽類肉瘤病毒高度保守區設計,不會跟其他病毒的RNA發生交叉反應。
5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。
6. 本產品只能用于科研。
規格及成分

編號

成分

規格

試劑一

探針法 qRT-PCR 緩沖液

500 μL(藍蓋)

試劑二

探針法 qRT-PCR 酶混合液

100 μL(紅蓋)

試劑三

熒光 PCR 專用模板稀釋液

1 mL(黃蓋)

試劑四

禽類肉瘤病毒探針法qRT-PCR引物混合液

100 μL(白蓋)

試劑五

禽類肉瘤病毒 qRT-PCR 探針

50 μL(棕色管)

試劑六

禽類肉瘤病毒探針法qRT-PCR陽性對照(1×10E8/μL)

50 μL(黃蓋)

使用手冊

1 份

運輸及保存
低溫運輸,-20℃保存,保存期限為 12 個月。
自備試劑: 
樣品 RNA。
使用方法:  
一、稀釋標準曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例):
由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備: 
7. 如果有 N 個樣品,最好設置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 RNA,本試劑盒跟市場上大多數病毒 RNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。
三、Probe qRT-PCR 反應(20μL 體系,在樣品制備室進行):
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復,則標記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),6個用于標準曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復,則標記 N+4 個 PCR管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),1 個用于 PCR 陽性對照(用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加):

成份

樣品管

N+2個

RT-PCR陰性對照管

標準曲線樣品管

(2-7管)

探針法 qRT-PCR 緩沖液

各 10 μL

10 μL

各 10 μL

探針法 qRT-PCR 酶混合液

各 2 μL

2 μL

各 2 μL

禽類肉瘤病毒 qRT-PCR 探針

各 1 μL

1 μL

各 1 μL

禽類肉瘤病毒探針qRT-PCR引物混合液

各 2 μL

2 μL

各 2 μL

待測樣品 RNA 模板

各 5 μL

--

--

超純水

--

5 μL

--

第7步所得標準曲線樣品稀釋液(2-7號)

不加

不加

各5 μL (2號樣到2號管,3號樣到3號管)

11. 蓋上蓋子后上機,按下面參數進行 qRT-PCR: 

過程

溫度

時間

逆轉錄

50℃

30 min

預變性

94℃

10 min

qRT-PCR反應35個循環

94℃

15 sec

60℃

1 min,(采集FAM通道的熒光信號)

四、數據處理:
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值,再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長,有典型擴增曲線,Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復一次。重復實驗的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性,如果小于 40,則為陽性。
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