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鴨乙型肝炎病毒cccDNA 染料法熒光定量PCR試劑盒

品牌:紀寧生物

貨號:JN32173

規格: 50次

聯系方式:021-54721350

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產品詳情

鴨乙型肝炎病毒cccDNA 染料法熒光定量PCR試劑盒
產品及特點
乙型肝炎病毒(HBV)共價閉合環狀 DNA(covalently closed circμLar DNA,cccDNA)是乙肝病毒前基因組 RNA 復制的原始模板,雖含量較少,每個肝細胞內只有約 5-50 個拷貝,但對乙肝病毒的復制以及感染狀態的建立具有十分重要的意義,只有清除了 cccDNA,才能徹底消除乙肝病毒攜帶狀態。因此靈敏快捷的診斷產品具有重要的意義。本公司產品開發鴨乙型肝炎病毒 cccDNA 染料法熒光定量 PCR 試劑盒,它具有下列特點:
1. 即開即用,用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據鴨乙型肝炎病毒cccDNA 保守序列設計的專一性引物,與相關病毒無交叉反應。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測,避免后續污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。
規格及成分

編號

成分

規格

試劑一

2×qPCR MagicMix

500 μL(棕色管)

試劑二

熒光 PCR 專用模板稀釋液

1 mL(黃蓋)

試劑三

鴨乙型肝炎病毒cccDNA 染料法PCR 引物混合液

100 μL(白蓋)

試劑四

鴨乙型肝炎病毒cccDNA 染料法PCR 陽性對

照(1×10E8 /μL)

50 μL(紅蓋)

試劑五

DNA 病毒裂解液(試用裝)

15 次(9 mL)

 

使用手冊

1 份

運輸及保存
低溫運輸、-20℃保存,有效期一年。
自備試劑: 
DNA 模板、10×ROX(根據機型決定,具體見使用方法)。
使用方法:  
一、稀釋PCR陽性對照(以10E2-10E7拷貝/μL這6 個 10倍稀釋度為例):
1. 注意:由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。
2. 標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液(最好用帶芯槍頭,下同)。
4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩 1 分鐘,得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中,充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備:  
8. 如果有 N 個樣品,必須設置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)。可以用 10μL 上步制備的 PCR 陽性對照的第 4號(濃度為 1×10E4 拷貝/μL,10μL 相當于 1 萬拷貝)或第 5 號(濃度為 1×10E5拷貝/μL,10μL 相當于 10 萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品,則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。
9. 用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。本試劑盒免費贈送 15 次一管式病毒 DNAout。
三、設置 qPCR 反應(20 μL 體系,在樣品制備室進行):
10. 如果只做 1 次重復,則標記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照,6 個用于 PCR 陽性對照。如果做 2-3 次重復,則反應設置數量相應增加 2 或 3 倍。
11. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加):

成分

樣品管 N+2 個

PCR 陰性 對照管

PCR陽性對照管(2-7 管)

2×qPCR MagicMix (棕色管)

10μL

10 μL

各 10 μL

鴨乙型肝炎病毒cccDNA PCR 引物混合液(白蓋)

2 μL

2 μL

2 μL

自備 10×ROX (見注)

2 μL

2 μL

各 2 μL

N+2 待測樣品 DNA 模板

6 μL

不加

不加

第 7 步所得 PCR 陽性對照稀釋液(2-7號)

 

不加

不加

各 6μL(2 號樣到 2 號管,3 號樣到 3 號管…)

注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照,其他熒光 PCR 儀器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX,則用水替代。
12. 蓋上蓋子后上機,按下面參數進行PCR(具體PCR參數可以根據儀器不同而自行優化)。 

 過程

溫度

時間

預變性

92℃

5分鐘

PCR反應30個循環

 

94℃

60秒

50℃

60秒

72℃

60秒

13. 數據采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合 DNA 時,最大吸收光譜在 471 nm,結合 DNA 時的最大吸收光譜在 500 nm,最大發射光譜在 530 nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。
四、數據處理:
14. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的log 值,再推算出其濃度。
15. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長,有典型擴增曲線,Ct 值應該小于或等于30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于40則為陰性,如果小于40,則為陽性。
友情鏈接:
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