科研工作者可以借用ELISA試劑盒分析每個(gè)樣本中存在特定抗原或抗體濃度。ELISA原理將待檢測(cè)抗原或抗體固定在微孔板上。然后，加入與目標(biāo)抗原或抗體特異性結(jié)合的檢測(cè)抗體。該檢測(cè)抗體通常與辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）等酶偶聯(lián)。在加入相應(yīng)的底物后，酶催化底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測(cè)的顏色變化或發(fā)光信號(hào)。通過酶標(biāo)儀讀取信號(hào)強(qiáng)度，可以確定樣本中目標(biāo)抗原或抗體的濃度。

圖1 elisa原理

  顯色分析

  這是目前最常用的方法，它也叫比色測(cè)定，其結(jié)果是產(chǎn)生有色反應(yīng)終產(chǎn)物，該終產(chǎn)物吸收可見光。已知反應(yīng)產(chǎn)物的光密度讀數(shù)與被檢測(cè)的分析物的量成正比。

  對(duì)于此過程，辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)偶聯(lián)抗體通常與顯色底物溶液(3,3′,5,5′四甲基聯(lián)苯胺，TMB)一起使用。TMB被視為一種極其敏感的底物，它可以產(chǎn)生可在650nm波長下測(cè)量的藍(lán)色。

  對(duì)于大多數(shù)比色測(cè)定，使用過氧化物酶或磷酸酶就足夠了。這兩種酶都可以與許多不同的底物一起使用，以產(chǎn)生定性或定量的ELISA結(jié)果。另一個(gè)重要點(diǎn)是這些底物可以產(chǎn)生有色的可溶性反應(yīng)產(chǎn)物。這是進(jìn)行ELISA測(cè)試時(shí)的想法。

  有許多因素會(huì)影響酶活性測(cè)量。影響ELISA的一些最常見因素包括溫度、pH條件、反應(yīng)時(shí)間、底物消耗、緩沖液成分、離子強(qiáng)度、酶變性、光照、蛋白質(zhì)抑制劑的積累以及由于產(chǎn)品濃度增加而導(dǎo)致的逆反應(yīng)增加。對(duì)于所有市售試劑盒，所有這些條件和因素都已優(yōu)化，以確保每次都能產(chǎn)生準(zhǔn)確的結(jié)果。

  此外，該方法反應(yīng)速度快，非常適合任何動(dòng)力學(xué)分析。該程序依靠吸光度來確定讀數(shù)，然后可以使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定分析物的未知濃度。

  熒光分析

  這些免疫測(cè)定法是顯色測(cè)定法的簡單變體。唯一的區(qū)別是HRP或AP偶聯(lián)檢測(cè)抗體使用熒光底物而不是比色底物。一般來說，這種方法提供稍高的信號(hào)和更寬的動(dòng)態(tài)范圍。與比色法設(shè)定的2.0-4.0OD限值相比，這可以更準(zhǔn)確地測(cè)量更高的讀數(shù)。這種方法的一個(gè)缺點(diǎn)是與比色底物相比，熒光底物的半衰期較短。

  該檢測(cè)法的一些特性包括：與比色法相比，靈敏度高100倍，效率高，不使用放射性物質(zhì)，安全且相對(duì)容易使用。但是，它會(huì)產(chǎn)生背景熒光干擾（可以使用黑色微孔板將其最小化），并且需要熒光計(jì)來讀取信號(hào)（這是一種相當(dāng)昂貴的設(shè)備）。

  目前市場(chǎng)上有許多不同的熒光計(jì)。在選擇特定儀器時(shí)，需要考慮的一些特性包括：可調(diào)節(jié)光檢測(cè)器、讀數(shù)室內(nèi)的熱一致性、數(shù)值可調(diào)增益、混合和匹配發(fā)射和激發(fā)波長、內(nèi)部背景控制機(jī)制、頂部和底部檢測(cè)的選擇、選擇每個(gè)孔的持續(xù)時(shí)間和讀取次數(shù)的選項(xiàng)。

  化學(xué)發(fā)光分析

  發(fā)光測(cè)定被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)ELISA程序的變體，與熒光免疫測(cè)定非常相似。本質(zhì)上，使用酶將底物轉(zhuǎn)化為反應(yīng)產(chǎn)物，該過程導(dǎo)致以質(zhì)子形式發(fā)光。這種測(cè)定中常用的一些酶是HRP和AP。

  發(fā)光過程可以定義為物質(zhì)從電子激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)發(fā)出的光。當(dāng)激發(fā)中間體返回基態(tài)時(shí)會(huì)釋放出質(zhì)子。釋放的質(zhì)子可以用可以測(cè)量發(fā)光信號(hào)的設(shè)備來檢測(cè)。

  發(fā)光有很多種形式，最常見的是化學(xué)發(fā)光、光致發(fā)光和生物發(fā)光。它們之間唯一真正的區(qū)別是達(dá)到激發(fā)態(tài)的方式。

  1.化學(xué)發(fā)光：光是由于化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的。

  2.光致發(fā)光：這是一種簡單的熒光過程，激發(fā)是由特定波長的光引起的。

  3.生物發(fā)光：使用具有生物發(fā)光特性的化合物，例如螢火蟲熒光素酶和熒光素。

  ELISA檢測(cè)最常用的方法是化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光。這些方法具有靈敏度高和動(dòng)態(tài)重測(cè)范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。測(cè)量的是相對(duì)光單位(RLU)，它們往往與樣本中存在的分析物量成正比。

  可以得出結(jié)論，上述每種檢測(cè)方法都有各自的要求，但是，通過這三種方法，可以開發(fā)出一種高度靈敏、精確和可重復(fù)的檢測(cè)方法，從而獲得一般準(zhǔn)確的結(jié)果。

  無論使用哪種方法，都有一些需要考慮的共同參數(shù)，例如使用適合所采用的方法和應(yīng)用的酶標(biāo)簽、選擇正確的酶和底物、創(chuàng)建優(yōu)化條件，最后使用正確的儀器進(jìn)行測(cè)量。