ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高校催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。根據(jù)檢測(cè)時(shí)標(biāo)本以及檢測(cè)目的等的不同具體可以設(shè)計(jì)出不同類型的ELISA方法，例如間接法、雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。

　　實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

　　先準(zhǔn)備好本次實(shí)驗(yàn)所需的各種試劑和耗材

　　1.試劑：

　　人TNF-αELISA試劑盒，包含：

　　預(yù)包被抗人TNF-α單抗的96孔酶標(biāo)板

　　凍干的人TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品

　　樣品稀釋液

　　生物素標(biāo)記的TNF-α抗體(或濃縮液，需自行稀釋)

　　親和素-HRP(或濃縮液，需自行稀釋)

　　TMB(POD)顯色底物

　　終止液

　　洗板液(濃縮液或即用型)

　　2.耗材：

　　1.5mL離心管

　　QSP盒裝吸頭(10µL,100µL,1000µL等，根據(jù)需要選擇)

　　冰盒

　　ELISA蓋板膜

　　3.儀器設(shè)備：

　　單通道移液器(可根據(jù)需要添加多通道移液器)

　　全波長(zhǎng)掃描多功能讀數(shù)儀(酶標(biāo)儀)

　　渦旋振蕩器

　　4.其他：

　　量筒/燒杯

　　吸水紙

　　計(jì)時(shí)器

　　實(shí)驗(yàn)操作

　　樣品稀釋

　　1.準(zhǔn)備稀釋液：將凍干的人TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品用適量超純水復(fù)溶，配制成濃度為2000pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品原液（或儲(chǔ)備液）。

　　2.標(biāo)記離心管：取8只1.5毫升離心管做好濃度標(biāo)記，按照濃度從高到低依次排列，并標(biāo)明單位。假設(shè)你想要配置的是從1000pg/mL開(kāi)始，5倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，那么8個(gè)離心管的濃度標(biāo)記應(yīng)該是：

　　1000pg/mL

　　200pg/mL

　　40pg/mL

　　8pg/mL

　　1.6pg/mL

　　0.32pg/mL

　　0.064pg/mL

　　0pg/mL(空白對(duì)照，通常用稀釋液代替)

　　3.加入稀釋液:在1000pg/mL到0.064pg/mL的7個(gè)離心管中，分別加入400µL稀釋液。在0pg/mL的空白對(duì)照管中加入900µL的稀釋液。

　　4.配制1000pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品:吸取100µL2000pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品原液加入到含有400µL稀釋液的1000pg/mL離心管中，充分混勻。

　　5.系列稀釋:從1000pg/mL的離心管中吸取100µL，加入到200pg/mL的離心管中，充分混勻。更換新的槍頭。從200pg/mL的離心管中吸取100µL，加入到40pg/mL的離心管中，充分混勻。更換新的槍頭。以此類推，直到稀釋到0.064pg/mL。每次轉(zhuǎn)移都必須更換新的槍頭。

　　6.空白對(duì)照:0pg/mL的離心管中不加標(biāo)準(zhǔn)品，只含有900µL的稀釋液。

　　免疫反應(yīng)

　　接下來(lái)進(jìn)入免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，將所有試劑從冰箱中取出，平衡至室溫。

　　按照50µL/孔的體積，將空白對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋后的待測(cè)樣品加入到酶標(biāo)板中。注意標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度依次加樣，并做好標(biāo)記。

　　加樣完畢后，輕輕拍打酶標(biāo)板，使液體充分混勻。用封板膜封住酶標(biāo)板，室溫孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，揭去封板膜，棄去孔內(nèi)液體，用洗板液洗滌酶標(biāo)板3次。

　　按照100µL/孔的體積，加入按說(shuō)明書稀釋好的生物素標(biāo)記的TNF-α二抗，用封板膜封住酶標(biāo)板，室溫孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，揭去封板膜，棄去孔內(nèi)液體，用洗板液洗滌酶標(biāo)板3次。

　　按照100µL/孔的體積，加入按說(shuō)明書稀釋好的HRP，用封板膜封住酶標(biāo)板，室溫避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，揭去封板膜，棄去孔內(nèi)液體，用洗板液洗滌酶標(biāo)板3次。

　　按照100µL/孔的體積，加入TMB顯色底物，用封板膜封住酶標(biāo)板，室溫避光孵育30分鐘(具體時(shí)間請(qǐng)參考試劑盒說(shuō)明書)。

　　加入終止液(例如硫酸或鹽酸)終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上，選擇合適的波長(zhǎng)(例如450nm,405nm或490nm，請(qǐng)參考試劑盒說(shuō)明書)讀取各孔的OD值。

　　最后大家可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析，因?yàn)槠邢蓿瑢?shí)驗(yàn)操作步驟分享到這里，上述實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考。如果您對(duì)ELISA實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)一步了解，可以和紀(jì)寧生物在線顧問(wèn)尋求幫助!紀(jì)寧生物也提供代測(cè)服務(wù)。