ELISA是最經(jīng)典的一種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)操作，中文名字叫酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。其原理就是利用抗體能和對(duì)應(yīng)的抗原蛋白分子特異結(jié)合，同時(shí)通過抗體上的酶聯(lián)標(biāo)記與底物反應(yīng)顯色或被激發(fā)而發(fā)光，最終間接完成抗原抗體復(fù)合物的觀察、檢測(cè)與定量。

圖1 為elisa原理

  其實(shí)elisa和westernblot很像，不同的是后者的待測(cè)物也就是蛋白質(zhì)，通常是在細(xì)胞內(nèi)，因此需要提取蛋白質(zhì)才能進(jìn)一步分離和檢測(cè)；而elisa的待檢測(cè)物通常已經(jīng)從細(xì)胞內(nèi)分泌出來到培養(yǎng)液中，因此他的前處理步驟更簡(jiǎn)單。

圖2 比色法蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)示意圖

  幾種不同的elisa方法對(duì)比

  ELISA根據(jù)檢測(cè)方法分為好幾類，分別是直接法、間接法和夾心法。

  直接法就是待檢測(cè)抗原黏附在微孔板的孔內(nèi)，然后使用帶酶標(biāo)的一抗與抗原結(jié)合，對(duì)吼加入底物進(jìn)行顯色，并檢測(cè)吸光度，由于吸光度的大小與抗原抗體復(fù)合物的數(shù)量成一定的線性關(guān)系，也就間接的實(shí)現(xiàn)了測(cè)定抗原數(shù)量的目標(biāo)。

  間接法和直接法的區(qū)別在于兩種抗體代替一種抗體，結(jié)合抗原的抗體（一抗）不帶酶標(biāo)記物，當(dāng)抗原抗體結(jié)合后再使用酶標(biāo)記的二抗結(jié)合一抗加入底物顯色并檢測(cè)。

  在間接法的基礎(chǔ)上，又再發(fā)展出更為復(fù)雜的夾心法，它在微孔板底部預(yù)先包被一種捕獲抗體，用于結(jié)合抗原，在這個(gè)復(fù)合物的基礎(chǔ)上再結(jié)合一抗、二抗并檢測(cè)。

  上述三種方法各有特點(diǎn)，目前來看夾心法的ELISA應(yīng)用最普遍，下面這個(gè)表格總結(jié)不同方法特點(diǎn)：

  接下來，我們繼續(xù)了解幾種比較特別的ELISA實(shí)驗(yàn)法，首先是競(jìng)爭(zhēng)法。如果待測(cè)抗原特別小，無法同時(shí)結(jié)合

  捕獲抗體和一抗的話，就不適合用夾心法檢測(cè)，此時(shí)可以在微孔板孔內(nèi)包被抗體，同時(shí)提供帶標(biāo)記的同種抗原，把待測(cè)抗原和標(biāo)記抗原一起加入和抗體結(jié)合，由于兩者會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，所以最終檢測(cè)的信號(hào)越高，證明待檢測(cè)抗原越少，反之則越多。

  另一種比較特別的是叫elispot,用于檢測(cè)細(xì)胞分泌出來的蛋白和細(xì)胞因子。預(yù)先在孔內(nèi)包被捕獲抗體，加入未處理/預(yù)先處理的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞分泌出特定蛋白或細(xì)胞因子時(shí)，就會(huì)被抗體捕獲。細(xì)胞裂解后孔內(nèi)只剩下細(xì)胞因子與捕獲抗體的復(fù)合物，此時(shí)再加入能結(jié)合的細(xì)胞因子的帶生物素標(biāo)記的抗體。最終通過顯色形成的斑點(diǎn)來計(jì)算分泌蛋白的數(shù)量。

圖3 為elispot實(shí)驗(yàn)示意圖

  最后一種就是in-cellelise。這種檢測(cè)在細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行，細(xì)胞是正常生長(zhǎng)的，在孔內(nèi)加入一抗結(jié)合細(xì)胞表面的特異蛋白，然后通過酶標(biāo)二抗結(jié)合一抗后進(jìn)行觀察。二抗可以是熒光標(biāo)記也可以是酶聯(lián)標(biāo)記